一文搞懂 PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 及优缺点

检验之星

PCR——实验室必备实验，从基因鉴定到信号通路验证，几乎每周都要做那么几次。

然而，各种PCR技术，包括PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR和dPCR，长得实在是太像了，好多同学看得头晕眼花也没弄明白这几种PCR有什么区别。
今天，一篇文章，带你清清楚楚，明明白白一次性搞明白各种PCR之间的区别。
一、什么是PCR？
PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是美国科学家Kary B. Mullis 1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。通过一系列精心设计的反应步骤，PCR可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。
在PCR技术出现之前，人们针对DNA进行研究的时候，通常都要十分的小心地使用这些核酸样品，因为在体外扩增的PCR技术出来之前，每份DNA样品都十分珍贵，研究者只能节约的使用。而PCR技术的出现打破了这种限制。Mullis 也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
PCR技术自问世以来，在生物科学领域、分子诊断领域等方面发挥了巨大作用，是迄今为止最为重要的技术之一。
二、PCR技术的介绍
按照PCR技术的演进，习惯将PCR技术划分为三代：普通PCR技术；实时荧光定量PCR技术（qPCR）；第三代数字PCR技术（dPCR）
（1）普通PCR技术
普通PCR即第一代PCR技术，以双链DNA为模板，以dNTP为底物进行扩增，特异性地扩增双链DNA的过程，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。
PCR的过程大致可分为高温变性、低温退火、适温延伸三个基本反应步骤。
① 高温变性：双链DNA模板经过高温（95℃左右）加热一定时间(10~30s)后，双螺旋的氢键断裂而变性解链变成单链DNA，成为合成DNA的活性模板。
② 低温退火：将温度降至55到60摄氏度之间，使得引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合，形成局部双链；
③ 适温延伸：再将温度调至72℃左右（DNA聚合酶最适反应温度），DNA模板和引物结合物可被DNA聚合酶识别，并在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成一条新的与模板 DNA 链互补的DNA链。
在经历一次变性→退火→延伸的流程之后，原本只有1条的DNA双链变成了2条；2次之后是4条；以此类推，经过变性、退火和延伸重复若干个循环后，就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。



（PCR的基本原理，来源：维基百科）

那在扩增完成之后我们需要对扩增出来的DNA进行检测，常规的PCR技术通常只能借助凝胶电泳手段，其是根据DNA的分子量大小不同对DNA进行分离，从而进行鉴定以及纯化DNA的技术。
优点：经典方法，国际和国内标准齐全，仪器试剂成本较低，PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验缺点：容易污染，操作繁琐，只能定性分析敏感性中等存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分
（2）实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
实时荧光定量PCR，即第二代PCR技术，是指在整个扩增的过程中，引入了荧光染料或者荧光基团，随着DNA数量的成倍增加，反应体系中的荧光信号也会增强。
在整个PCR反应过程中，借助对荧光信号的强弱进行检测实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测检测样品进行定量分析。
目前根据不同的荧光物质，我们可以大致将qPCR分为两种。
■ 一种是用荧光染料，主要为SYBRGreenⅠ染料，该染料能与DNA双链结合，结合之后会显示荧光信号，而在没有结合的时候几乎检测不到荧光信号，随着拷贝数的增加，荧光信号增强。
优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。
缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。
■ 而还有一种是使用荧光探针，又叫TaqMan探针法，其原理是根据目的基因设计一个能与之特异性结合的荧光探针，该探针包含两个基团：一个荧光基团和一个淬灭基团，正常情况下因为淬灭基团的存在导致荧光基团无法发出荧光，而在扩增时探针结合到DNA的模板上，并且扩增到探针位置时两个基团被切开，从而荧光基团可以发出荧光，同样随着拷贝数的增加，荧光信号增强。
优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。
缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。



荧光染料法和荧光探针法的工作原理（DOI:10.3390/molecules25030706）

借助qPCR技术，我们可以不用在每次做完PCR之后去辛苦的跑电泳，也可以更精确的分析我们的PCR结果。由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速，现在已经涉及到生命科学研究的各个领域。
Ps：Real-time PCR和qPCR是一码事，都是实时荧光定量PCR。
（3）数字PCR
数字PCR（Digital PCR，Dig-PCR，dPCR）即第三代PCR技术，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝对定量的精准检测技术。
基于泊松分布原理，数字PCR技术核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对计数，提高检测灵敏度和准确度。
这是目前全新的一种 PCR 检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。
由于这种检测方式具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性，数字 PCR迅速得到广泛的关注，尤其在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测、核酸拷贝数变异和基因表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。
优点：实现绝对定量，更高的敏感性和特异性，可以检测低拷贝样品
缺点：仪器设备和试剂昂贵，操作复杂，检测时间长，检测范围较窄


数字PCR检测技术原理
（图源：DOI:10.1016/j.transci.2019.102708）
（三）易混淆的PCR概念
很多人误以为RT-PCR是Real-time PCR的缩写，因此将二者混为一谈，但实际上是不一样的，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR）（见前面的介绍）。
下面详细介绍反转录PCR
（1）反转录PCR
反转录PCR（Reverse Transcription - PCR，RT-PCR），是PCR的一种广泛应用的变形。RT-PCR 结合了反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（PCR）的过程。
该技术的一般过程为，首先以RNA为模板在反转录酶的作用下合成其对应cDNA，再以cDNA为模板通过PCR进行DNA扩增。归根结底，其就是在PCR过程前加了一个反转录过程，之后既可以进行普通PCR。
RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
（2）实时荧光定量反转录PCR（Real-time RT-PCR，RT-qPCR）
实时荧光定量反转录PCR（Real-time RT-PCR，RT-qPCR）是qPCR和RT-PCR的组合，所以RT-qPCR（也有人写成qRT-PCR）是结合了荧光定量技术的反转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析（RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析）。


图源：（DOI: 10.1063/5.0021270）
PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术的主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的扩增和检测；而RT-qPCR则结合了RT-PCR和qPCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。
（四）总结
1.PCR，通常指的是普通PCR，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，定性扩增双链DNA。
2.qPCR和Real-time PCR，指的是实时荧光定量PCR，以cDNA为模板，以dNTP 为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。
3.RT-PCR，指的是逆转录PCR，以由mRNA逆转录成的cDNA为模板，以dNTP 为底物，进行DNA的扩增，属于PCR的变种，结果只能定性，不能定量。
4.RT-qPCR，指的是实时荧光定量逆转录PCR，是qPCR+RT-PCR的组合，将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板，以dNTP为底物，进行qPCR的定量分析。
不同PCR方法的主要优缺点：


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