免疫组化步骤及原理整理

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免疫组织化学
免疫组织化学(Immunohistochemistry,  IHC)技术是根据抗原抗体反应原理而发展起来的染色技术，广泛的应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。因此，掌握免疫组化的技术可以提高我们实验技术手段。小编通过资料整理在以下几个方面进行介绍。

免疫组织化学技术的发展
20世纪40年代，Coons首先应用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原，为免疫组织化学技术的发展奠定了基础[1]。1966年，nakane成功地把辣根过氧化物酶(Horseradish-peroxidase,HRP)标记在抗体分子上，建立酶标记抗体技术[2]。1974年，Stemberger 对上述技术进行了改良，建立过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）技术。1981年，徐世明等建立了亲和免疫细胞化学，又称亲和素和生物素（ABC）法[3]。随着原位PCR技术和分子杂交技术的建立使得免疫组化技术的更加成熟。

免疫组化步骤
1.检测标本
    免疫组织化学技术可用于检测石蜡切片、冰冻切片及细胞涂片。大部分抗体可用于石蜡切片，而适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片和细胞涂片。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织抗原，但是缺点也很明显，组织形态结构较差，定位不是很清晰。石蜡切片的优点是组织形态结构好，定位清晰，但是在样品的处理过程中容易破坏组织抗原[4]。下面主要是围绕实验室常用的石蜡切片的操作进行总结。
2.组织固定
    组织离体后应立即进行固定，尽可能保存组织细胞内的抗原成分和原有的形态结构，防止组织抗原弥散。固定的方式多采用固定液浸泡组织，常用的固定液是甲醛，固定液的浓度是4%甲醛溶液（10%福尔马林溶液，PH7.2-7.4），固定液用量大概是组织的10-20倍，标记的组织块不宜过大。判断组织是否固定良好，可以取出已经固定完毕的组织标本用刀切开，如固定良好，其切面呈灰白色，质感较硬而具有弹性。
3.组织脱水
    从固定液中取出的组织，建议用流水冲洗，去除过多的固定液和组织所产生的分解产物，避免污染组织。组织脱水的目的是使得组织内的水分逐步被替换出来，因为组织制成蜡块是要求组织要被熔化的石蜡所浸透，因为石蜡和水不相溶，脱水干净后才有助于下一步组织的浸蜡。脱水一般采用从低到高浓度乙醇脱水，组织经过70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，其中95%乙醇和100%乙醇经两缸试剂脱水。
4.组织透明
    组织透明的目的是把脱水剂乙醇将组织内用透明剂（二甲苯）置换出来，以利于熔化的石蜡进入组织，组织经脱水透明后，肉眼可见整块组织呈透明状，没有白色浑浊的状态，常用的透明剂是二甲苯，在室温透明时间，组织透明时间以30-60分钟为宜，不宜过长，依据组织的大小肉眼观察组织适当调整透明时间。
5.组织浸蜡和包埋
    常用的包埋剂是石蜡，石蜡在60-62℃电热恒温箱内保持熔化状态，将组织在其内浸透一定时间，一般组织一般为2-4小时，分2缸石蜡按顺序进行操作。包埋时将包埋模具放在自动包埋机的出蜡嘴下方，注入熔化的石蜡，用镊子把组织轻轻按平，放在自动包埋机的冷冻台上凝固，凝固后脱去包埋模具。
6.石蜡切片
    切片厚度一般为4-5μm，展片可先放在5%-10%的乙醇内然后转移到恒温（40-46℃）水中。贴片后切片放满一抽，放入60-65℃烤箱中烤片20-30分钟，使得水分蒸发和石蜡熔化，取出即可进行染色。也可45℃烤片数小时，直至将蜡片水分烤干，烤片后的白片可在4℃进行保存。
7. 抗原修复
    常用的抗原修复方法主要有蛋白酶法和热处理法。主要介绍热处理法，热处理主要包括加热、微波炉加热和高压锅加热，热处理的溶液常用的是柠檬酸缓冲液（PH=6.0）。加热条件为：水浴锅100℃15分钟，微波炉加热使温度保持在95-100摄氏度，总时间10分钟，中间有间隔。
8.内源性酶的消除
   组织中的一些细胞如红细胞、粒细胞等存在内源性过氧化物酶，这些酶与辣根过氧化酶类似也可以与显色剂DAB结合，进而造成假阳性，实验中可通过用3%的过氧化氢水溶液作用15分钟，消除内源性过氧化物酶操作可以在加一抗之前操作也可在加一抗之后操作。
9.血清封闭
    血清封闭的目的是去除非特异性的吸附，用正常的非免疫动物血清封闭组织中的能和抗体结合的位点，减少非特异性的背景，如二抗使用的是山羊抗兔的血清，则封闭血清选择正常的山羊血清。血清封闭后，不用PBS冲洗，直接弃去即可，直接滴加一抗。
10.抗体孵育
    根据实验需要选择目标一抗，可根据抗体说明书选择抗原修复的条件，初次实验时建议，稀释不同抗体的浓度，优化最佳的抗体浓度。
11.显色与复染
    常用的染色剂主要是3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）,可以直接购买商品化的试剂，DAB的显色原理是在HRP的催化下，H2O2将DAB氧化成还原型的DAB,还原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀。常见的细胞核复染试剂有苏木素、甲基绿和核固红，依据对比清晰的原则，DAB的细胞核复染主要用苏木素。苏木素复染后脱水、透明用中性树胶封片。

步骤简易总结
二甲苯脱蜡20分钟×2
梯度酒精复水（100%×2、95%、90%、85%、蒸馏水，每次5分钟）
抗原修复（加热法）
3%双氧水阻断非特异性
二抗同种属血清封闭
一抗4℃孵育过夜
孵育二抗
DAB显色
苏木素复染
脱水透明，中性树胶封片



图片资料来源：https://www.vzkoo.com/news/1898.html?pid=

参考文献
[1]王洪苏, 关桂静, 刘金香. Alexa Fluor荧光标记在细胞学和分子生物学研究中的应用[C]// 中国植物病理学会2015年学术年会论文集. 2015.
[2] 殷德民. 免疫酶细胞化学技术[J]. 组织工程与重建外科杂志, 2006, 2(6):341-343.
[3] 王伯沄. 分子病理技术的进展——免疫组织化学的新进展[C]// 全国诊断病理暨诊断及相关技术标准化学术研讨会. 中华医学会病理学分会;中华病理学杂志编辑委员会;南京军区南京总医院, 2008.
[4] 梁英杰, 凌启波, 张威. 临床病理学技术[M]. 人民卫生出版社, 2011.

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/513756253