微流控芯片在细胞培养检测中的应用

笑看风云

微流控芯片系统由于分析速度快、试剂消耗少、便于集成和高通量分析等优点而被广泛应用于生化分析等各领域.过去20年中，伴随材料科学的发展以及利用微加工技术操纵小尺度微流体的实现，微流控芯片技术取得了巨大的进步，目前，基于细胞、组织培养的微流控芯片系统已应用到高通量筛选、药物开发及毒性测试等领域，未来还可将其应用到再生医学等相关技术中.


水凝胶是一种三维亲水性网络状聚合物，因其具有高含水量及灵活多变的柔性结构，并易于模拟活体组织而被广泛应用于生物医学工程领域.聚乙二醇PEG)基水凝胶材料的生物相容性好、免疫原性低且可操控性强，可通过物理或化学交联的方法得到不同结构和功能的水凝胶，其中PEG丙烯酸酯类衍生物因具有较好的光聚合性能而成为最常用的PEG基水凝胶前体"”.在光引发剂和紫外光作用下，聚乙二醇双丙烯酸酯能在室温下迅速聚合成PEGDA水凝胶，反应时间短、成型快且耗能低·此外，紫外光聚合反应可实现空间与时间上的可控，形成结构多样的水凝胶，不仅可以作为药物载体或组织修复与再生的细胞支架材料，还可作为构建微流控芯片细胞培养平台的基质材料.我们利用PEGDA水凝胶材料的上述优点，将其用于构建细胞培养及检测的微流控芯片，通过紫外光聚合反应直接加工具有不同微结构的适于细胞培养及检测的双层水凝胶微流控芯片，建立了一种快速、高效且低成本的水凝胶微流控芯片加工方法.结合自主研发的卟啉可视阵列传感器系统，实现了芯片细胞培养平台上的细胞代谢指纹快速可视化传感检测.


芯片上的细胞培养
将制作好的芯片置于75%(体积分数)的乙醇中浸泡1h，再用紫外灯照射1h进行灭菌外理.将消毒后的芯片在无菌PBS缓冲溶液中漂洗，再转入细胞培养液中浸泡.将芯片置于37℃、5%CO₂(体积分数)的培养箱中孵育24h，再接种细胞悬液.用微量移液器将细胞悬液从芯片入口处缓慢接种至芯片中，细胞接种密度为2x10°cells/mL.静置片刻后，再从入口处缓慢灌注培养液，使未被微井捕获的细胞从出口处移出·将芯片置于培养皿内，放入培养箱中培养4h后更换新鲜培养基，此后以灌流的方式为芯片上所培养的细胞换液，并收集出口处的代谢液.
肿瘤细胞代谢指纹可视化传感检测
通过标准化的培养过程，在芯片上分别培养HepG2人肝癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞和MCF-7人乳腺癌细胞并收集其代谢液.采用我们自主研发的卟啉可视阵列传感器系统对肿瘤细胞代谢液进行检测.该传感器系统以卟啉及其衍生物和特异性染料作为传感单元，传感单元具有交叉敏感响应，每个传感单元对不同代谢组分具有不同的响应能力，通过模式识别的方法对代谢物进行识别，实现对细胞的整体代谢特征响应并得到特征代谢指纹图谱，从而实现对代谢物的区分检测，其检测过程如图2所示，通过采集传感阵列与细胞代谢液反应前后的可见光区阵列光谱图，系统软件自动提取并保存阵列上每个点的红R，绿G)和蓝B)数值，经标准化处理后得到反应前后的阵列响应红绿蓝RGB差谱图，通过软件分析可实现对目标物的识别.
芯片上的细胞捕获与培养
细胞在芯片内的分布通过芯片中的3x15微井阵列捕获细胞来实现.细胞进入培养腔后，随着微流体的流动通过重力作用而被微井结构捕获，并固定在微井结构中，未被捕获的细胞则随着流体从出口处移出，这样的微井阵列结构可有效控制细胞的分布，以便观察和分析.当一个微井结构布满细胞后，细胞将流向下一个微井，使细胞均匀分布在每个微井结构中，与常规培养方式相比可有效提高细胞分析的准确性和可信度.图4为细胞进样前后显微镜下的微井结构图，图4A)显示微井结构边缘光滑整齐、分辨率高;图4B)显示细胞进样后被微井结构所捕获，均匀分布在各个微井结构中.重复性及平行性实验表明，该微井结构对细胞具有很好的捕获能力，并且水凝胶材料可以很好地模拟组织细胞生长的微环境，细胞在微井中生长状况良好，细胞活性强.


肿瘤细胞代谢指纹检测
收集HepG2人肝癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞和MCF-7人乳腺癌细胞3种肿瘤细胞代谢液，用卟啉可视阵列传感器系统对其进行检测，所得可视指纹图谱如图5所示.由图5可见，传感阵列对肿瘤细胞代谢物具有显著的响应，且对不同肿瘤细胞的响应结果不同，说明每种肿瘤细胞均具有各自特异的代谢指纹图谱，用目视的方法即可区分.对3种肿瘤细胞代谢液检测的RGB差谱数据进行聚类分析HCA及主成分分析PCA，结果如图6所示.由HCA分析图可见，聚类效果明显，每种肿瘤细胞的5组平行样各自汇聚在一起，能较好地识别和区分3种肿瘤细胞;并且同种肿瘤细胞的5组平行样间聚类较近，说明实验具有相对稳定的重复性。而通过主成分分析图，在由前三维主成分为轴的立体空间内，同种细胞很好地团簇在一起.卟啉可视阵列传感器系统能够有效识别不同种类肿瘤细胞的整体代谢特征，以水凝胶微流控芯片为细胞培养、检测平台并结合卟啉可视阵列传感器系统可实现对细胞代谢情况的快速检测与区分.利用 PEG基水凝胶材料的紫外光聚合性能，通过掩模选择性地聚合水凝胶材料，设计并制作了用于细胞培养及检测的双层水凝胶微流控芯片·显微观察及生物学代谢检测实验结果表明，该芯片的微井结构对细胞具有高效的捕获与培养能力，且能够有效控制细胞在芯片内的空间分布.PEG基水凝胶微流控芯片的制作工序简单，加工成本低，且易于对水凝胶材料进行各种修饰以模拟组织细胞生长的微环境，非常适用于细胞生物学研究.将其与卟啉可视阵列传感器系统结合使用，可实现芯片细胞培养平台上的细胞代谢指纹快速可视化传感检测.
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