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Basic Information Para_01 液体活检作为一种无创检测和追踪癌症的方法，受到了极大的关注。 在此，我们讨论了关于循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞的最新研究进展，涉及其在临床应用中的多个方面，包括癌症筛查、复发的早期检测、治疗效果的实时监测以及治疗靶点和耐药机制的检测。 Main text Introduction 介绍 Para_01 组织活检是目前的诊断标准，但它们是有创程序，可能有副作用（例如，出血、感染），并且某些部位难以到达（例如，肺或脑中的转移灶）。 对一个可及的转移病灶（例如，皮肤转移）进行单一活检可能无法代表同一患者脑或肺转移灶的基因组构成。 相比之下，血液是一个肿瘤细胞及其产物的混合池，原则上这些产物来自癌症患者的全部肿瘤病灶。 最重要的是，采集血液侵入性极小，因此可以轻松重复进行，这使得能够实时监测肿瘤的演化和个体患者对治疗的反应。 在以治愈为目的接受治疗的患者中，基于血液的监测能够检测和分子表征微小残留病（MRD），并比当前成像方法提前数月早期发现复发。 通过液体活检（LB）——这一术语于2010年引入——追踪癌症被最新一期《自然》里程碑系列评为过去20年最重要的发现之一。 Para_02 在这里，我们将讨论液体活检（LB）在癌症管理中的不同临床应用，从癌症的诊断到转移性疾病（图1）。 我们将重点关注循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环肿瘤细胞（CTC），因为它们是目前研究最为深入的液体活检标志物。 图片说明 - 图1. 当前临床上使用的液体活检（LB）检测方法的概况——需要LB检测/平台的适应症/临床场景。癌症管理中液体活检的应用，从诊断到患者去世，包括筛查/诊断、治疗选择和监测、微小残留病灶（MRD）检测以及耐药性检测。 - 该图展示了在液体活检中检测和表征的各种肿瘤来源或肿瘤诱导的循环生物标志物（循环肿瘤细胞、ctDNA、外泌体、肿瘤教育血小板、循环RNA、蛋白质、循环内皮细胞、白细胞和循环微生物组），这些标志物单独或联合具有潜在的临床相关性。 - 在不同时间点进行的液体活检可以提供关于癌症状态及其演变的关键实时信息，从而为每位癌症患者提出最佳的个性化治疗决策。 Early detection of cancer 癌症的早期检测 Para_02 癌症的早期检测是公众关注最高的 LB 应用之一。 技术挑战在于，为了检测可能仅向血液中释放极少量循环肿瘤细胞（CTCs）或 DNA 片段的小肿瘤，需要极其敏感的检测方法。 对于 CTCs，目前正开发更敏感的技术，而作为远处转移的过渡器官在血液中检测到完整的肿瘤细胞可能表明肿瘤已经扩散。 对于循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测，所需的检测灵敏度至少为 0.01% 的变异等位基因频率（VAF）或更低，这可以通过几种现有技术实现。 由于隐匿性肿瘤的分子组成事先未知，如果该检测用于大规模人群筛查项目中的多癌种早期检测（MCED），则需要涵盖多种不同肿瘤类型的驱动基因的大规模检测面板。 或者，LB 检测可用于检测特定高危个体中的某种肿瘤类型，这可能需要一个范围较小的检测面板。 例如，高风险囊肿、胰腺导管内乳头状黏液瘤或晚发性糖尿病患者有较高的胰腺癌发病风险，因此成为欧盟资助的 PANCAID 项目（https://pancaid-project.eu/ ）和法国 PANLIPSY 试验（NCT06128343）的目标人群，此外还包括具有遗传性癌症风险的家庭成员。 Para_03 除了突变外，对 cfDNA 上的甲基化特征进行检测是一种有前景的方法。 例如，前瞻性多中心 PATHFINDER 研究（NCT: 04241796）分析了 6,621 名 50 岁或以上且无已知肿瘤疾病的患者，并在其中 1.4% 的人中发现了可疑特征。 约 50% 的病例中检测到了早期癌症（I 期和 II 期），这表明还有改进的空间。 另一种方法是基于对血浆中 ctDNA 片段进行全面分析的片段组学，作为 MCED 测试，该方法也显示出有希望的结果。 Para_04 尽管取得了有希望的结果，癌症的早期检测仍是液体活检测试最具挑战性的应用之一。 总体而言，早期阶段（T1）肿瘤的检测仍需改进。 结合不同的液体活检标志物可能提高检测早期甚至癌前病变的检测灵敏度。 此外，目前仍然缺乏长期随访数据，并且尚需证明"早期检测"是否足够早以治愈通过血液检测发现的特定肿瘤类型。 这取决于针对特定肿瘤类型的可用治疗选择。 临床管理因肿瘤类型而异，且血液检测需要整合到诊断流程中。 如果患者带着阳性血液检测结果去看医生，定位信息将至关重要。 甲基化特征可以提供肿瘤起源信息。 此外，结合复杂人工智能应用的多模式检测可能有助于提高液体活检的准确性。 另一个挑战是如何处理偶然发现（例如，在孕妇进行无创产前检测时检测到的癌症信号）。 Surveillance of relapse after initial therapy 初始治疗后复发的监测 Para_02 癌症早期检测的另一项应用是通过连续血液分析，在癌症患者的随访过程中检测初始治疗后的复发情况。 与用于癌症早期检测的 MECD 测试相比，其优势在于已知肿瘤类型，这使得可以更精确地使用针对特定肿瘤类型甚至个体化的测试。 Para_03 关于CTC，多中心开放的III期研究SUCCESS-A纳入了1,087名III期乳腺癌患者。 在24个月随访时检测到CTC是无病生存和总生存的独立、具有统计学意义的不良预后因素。 Sparano等人也提供了类似的数据，显示在乳腺癌初始治疗5年后检测到CTC的情况。 因此，CTC表明存在释放细胞进入循环的隐匿性微转移，因此在当前影像技术揭示明显的转移病灶之前就可以检测到CTC。 Para_04 对于循环肿瘤DNA（ctDNA），可以对个体肿瘤进行测序，以设计针对患者的特异性探针，用于在血液中对癌症信号进行超敏感监测。 多项跨越不同癌症类型的研究表明，与标准护理监测相比，连续监测ctDNA在复发检测方面具有显著的提前时间（长达超过1年），其中在结直肠癌（CRC）领域取得了最显著的进展。 特别是，在微小残留病灶（MRD）阴性的患者中是否可以减少辅助治疗的问题至关重要，但这需要精心设计的干预性研究。 例如，如果II期结直肠癌患者的ctDNA血液检测结果为阴性，则可能不需要接受辅助化疗。 在监测期间，精确检测外周血中存在的微量ctDNA片段（通常占循环无细胞DNA总量的不到0.1%）仍然具有技术挑战性，正如最近欧洲肿瘤内科学会发布的ctDNA指南所指出的那样，这突显了对更敏感技术和大量临床验证研究的需求（例如，通过液体活检指导多模式抗MRD疗法，GUIDE.MRD [https://www.guidemrd-horizon.eu/ ]). 此外，如何治疗液体活检阳性个体仍有待确定，并且是正在进行的临床研究的主题。 Monitoring therapy response in advanced cancers (toward RECIST_2.0) 监测晚期癌症的治疗反应（迈向RECIST_2.0） Para_02 目前评估治疗反应的方法基于影像学检查，并按照大多数临床研究中使用的 EORTC RECIST 标准定义（https://recist.eortc.org/ ）。 然而，无进展生存期作为结果参数的可靠性一直存在争议，近期的一些观点文章建议根据液体活检（特别是循环肿瘤 DNA，ctDNA）结果开发扩展的 RECIST 标准。 除了 ctDNA，对转移性乳腺癌患者循环肿瘤细胞（CTC）计数的评估也显示出用于治疗决策的临床价值。 Para_03 尽管大量研究表明，在多种肿瘤类型中，ctDNA测量与临床结果之间存在显著相关性，但这些研究在纳入的样本数量、临床队列类型以及用于测量ctDNA的方法学方面存在很高的异质性，包括不同的敏感性阈值和定量策略。 值得注意的是，迄今为止大多数研究仅证明了ctDNA作为生物标志物的临床有效性。 因此，将ctDNA值用作疗效评估的生物标志物需要为每种特定检测方法和每种特定肿瘤类型建立精确的治疗前和治疗中的ctDNA临界值。 此外，还需要干预性研究来证明这些ctDNA临界值的临床实用性。 另外，有必要更好地了解ctDNA的日间变异性和方法的可重复性。 Para_04 除了敏感性差异外，ctDNA检测与影像学之间存在差异的一个潜在来源可能是由于各种免疫细胞浸润肿瘤组织导致的假性进展，这会促使肿瘤体积增大。 假性进展是与免疫检查点抑制剂（ICI）治疗相关的一项特殊挑战，而ctDNA测量有助于将其与真实进展区分开来。 Profiling of therapeutic targets and resistant mechanisms 治疗靶点和耐药机制的分析 Para_02 精准肿瘤学的目的是根据液体活检结果调整治疗方案，特别是在转移性组织经常无法获取的晚期疾病患者中。 此外，与组织活检相比，这种方法可以减少成本、时间和患者的发病率及死亡率。 而且，传统的组织活检可能无法揭示肿瘤疾病的异质性（例如，同一患者不同部位转移灶的异质性）。 然而，血液是一个包含肿瘤来源细胞和来自不同部位释放的DNA的混合池，应能提供比单一转移病灶组织活检更全面的信息。 Para_03 此外，靶向免疫疗法（尤其是免疫检查点抑制剂，ICI）改变了肿瘤学临床试验的格局，并已应用于多种肿瘤实体的临床实践，例如非小细胞肺癌、黑色素瘤和尿路上皮膀胱癌。 然而，只有少数患者对这些新的免疫疗法产生反应，而对抗药机制和液体活检测试的研究可能有助于早期识别应答者和非应答者，从而在疾病进程无法逆转之前及时调整治疗方案。 除了肿瘤特征外，宿主（患者）也会影响免疫疗法的成功或失败（例如，凝血系统会影响晚期黑色素瘤患者对ICI治疗的抗药性）。 Para_04 迄今为止，ctDNA检测在识别调控癌症表型及其病程中动态变化的转录程序方面能力有限。 几个团队描述了能够提供转录活性稳健代理的检测方法，使我们能够推断诊断标志物和药物靶点的表达水平。 Para_05 除了分析循环游离DNA（cfDNA）外，针对治疗靶点的循环肿瘤细胞（CTC）表型分析也为干预性研究开辟了新领域。 这种表型分析在那些原发肿瘤切除后多年才发生转移复发的肿瘤类型中尤其有用，因为有足够的时间让表型发生转变，而这种转变只有通过获取转移病灶组织才能检测到。 在这里，由转移病灶释放的CTC可以作为一种易于获取且侵入性最小的转移性肿瘤细胞来源，并且其优势在于转移患者的CTC数量高于早期患者的CTC数量。 这一新概念已在随机干预性DETECT III试验中得到验证：初始HER2阴性的原发乳腺癌患者，在发生转移性复发时血液中检测到HER2阳性的CTC，这些患者在接受标准治疗的同时额外使用双靶向EGFR/HER2抑制剂拉帕替尼治疗，结果表明与单独的标准治疗相比，该方案带来了生存获益。 Conclusions and perspectives 结论与展望 Para_01 LB为理解肿瘤进展在个体患者中的演变开辟了新的途径，这对癌症患者的管理具有重要影响。 Para_02 为了早期检测原发性癌症或微小残留病/复发，需要使用超敏检测方法来检测微量的循环肿瘤DNA（ctDNA）。 然而，灵敏度的提高可能伴随特异性的降低。 例如，老化个体中的突变"背景"会影响血液细胞（所谓的未定潜能克隆性造血突变），但癌变突变也可能存在于病理学家分类为"正常"的上皮细胞中。 此外，DNA甲基化会随着年龄、炎症和其他慢性疾病状况而变化。 因此，不能排除存在一种与肿瘤相关的基因组和表观遗传异常的"背景"，这可能会影响ctDNA检测的特异性。 因此，需要对大规模年龄匹配的非癌症对照组进行全面分析，以避免假阳性结果。 Para_03 深入了解LB标志物背后的生物学机制对于提高这些生物标志物的临床应用至关重要。 特别是，在肿瘤发生和发展中具有功能的生物标志物可能尤为值得关注。 迄今为止，不能排除cfDNA片段也可能干扰与癌症进展相关的过程（例如，影响中性粒细胞胞外陷阱的生成或通过胞外囊泡将宿主细胞转染）。 ctDNA释放和清除的生物学机制仍在研究中，最近的研究表明，癌症可能会对细胞周转或DNA清除产生系统性影响。 Para_04 循环肿瘤细胞（CTCs）本质上是功能性生物标志物。 研究表明，CTCs通过血液循环的过程并非仅仅是被动脱落，而是一个主动过程，支持了对最适应克隆的选择。 此外，数学模型表明，CTCs在血液中的存活似乎是决定转移进展的关键参数。 另外，作为另一种功能性生物标志物，细胞外囊泡（EVs）在通过血液进行长距离通讯中发挥重要作用，例如参与建立远处器官的前转移微环境或干扰抗肿瘤免疫反应。 Para_05 现在以及将来很可能不存在一种能够满足所有临床需求的检测方法，而是所选择的液体活检测试可能取决于特定的肿瘤类型、阶段或治疗方案。 目前，人们非常关注单一的液体活检生物标志物；然而，一些研究已经表明，多种液体活检生物标志物的组合可能会提高检测的准确性。 此外，大多数液体活检研究集中在肿瘤负荷或特征上，但肿瘤的自然进展和对治疗的耐药性可能既依赖于肿瘤反应，也依赖于宿主反应（包括局部和全身反应）。 外周血中的液体活检测量在多大程度上能反映肿瘤微环境，仍是正在进行的研究课题。 Para_06 鉴于癌症的分子复杂性及其克隆进化导致越来越具侵袭性的克隆出现，我们认为需要一整套循环生物标志物的互补性，才能获得关于癌症自然演变和治疗诱导演化的全面且实时的信息。 尽管对循环肿瘤DNA（ctDNA）有极大的关注，我们坚信结合其他液体活检标志物将提供比单一标志物类别更多的信息，我们也相信具有肿瘤生物学功能作用的细胞标志物（如循环肿瘤细胞或外泌体）不应被忽视。 Para_07 最重要的是，干预性临床研究对于证明液体活检（LB）评估的临床价值至关重要，以表明血液检测对癌症患者有显著益处。 例如，普遍认为液体活检可以比影像学提前数月检测到肿瘤疾病的进展，但这是否能带来延长患者生存期和/或提高生活质量的治疗结果呢？ 已发表的首批干预性临床试验报告显示，使用液体活检进行治疗决策能够带来生存益处。 这类研究也与决定新诊断测试报销的监管机构相关。 当然，报销对于使所有癌症患者都能获得液体活检至关重要。 为了将液体活检分析从发现和验证阶段推进到临床常规应用，需要对这些分析方法进行验证和标准化，包括实施可靠的质控措施，例如使用具有明确遗传变异的标准 DNA 片段。 全球多个联盟正在这一领域积极开展工作，例如 ELBS（https://www.elbs.eu ）。 Acknowledgments Para_01 K.P. 从德国研究基金会优先计划 SPP 2084 microBONE（DFG）、德国癌症援助项目 CUPIDO 和欧洲研究委员会（ERC）高级研究者资助 INJURMET（编号 834974）获得了资金支持。 C.A.-P. 从法国癌症研究基金会 ARC 的项目 PANLIPSY（关于液体活检和胰腺癌）、国家癌症研究所（INCa）以及 AFER 医学研究捐赠基金获得了资金支持。 Author contributions Para_01 C.A-P. 和 K.P. 构思了这篇评论，进行了文献检索并起草了初稿，提供了关键修改意见并参与了稿件结构和内容的构建，撰写了特定章节，审查并编辑了稿件的重要学术内容，监督了整个项目，并对最终发表版本给予了批准。 Declaration of interests Para_01
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