免疫组化常见问题及经验总结(一）

千姿百态

前言：

今天这期咱们漫谈组化，总结整理了一些个人以及书籍、论坛、公号等的经验，方便自己温故知新和萌新学习。
由于内容太多，分两期发，今天先发第一期。




固定



为什么要固定？

• 固定的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败，固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。
  

常见组织及固定液选择

• 常规的组织细胞固定都采用甲醛固定的方法，即10%中性甲醛液，目前它仍是组织细胞的最佳固定液，优点是具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。
  
• 但它的缺点也是明显的，首先它具很高的毒性，对病理技术人员有很大的危害性，再者经甲醛固定的标本不能满足一些特殊染色的需要，对组织细胞中的很多成分保存不力。
  
• 淋巴结、胸腺、脾脏：新鲜的淋巴结样本应尽快进行取材和固定。对于厚度为0.3cm的淋巴结组织块，采用10%中性缓冲甲醛溶液固定的时间以12小时为佳；对于厚度为0.2cm的组织块经6小时固定也可获较满意的制片效果。
  
• 肾脏：可采用乙醇Bouin液固定；肾穿标本可采用PB-FA（甲醛10mL+纯乙醇70m l+浓度为0.05mol/L pH 7.2磷酸缓冲液20ml）固定液。
  
• 前列腺、睾丸：Bouin’s 液或用Hollande固定液 （它 “软化”组织可避免切片脆裂，苦味酸会溶解掉红细胞，对骨髓活检标本还可以起到脱钙作用）。
  
• 肝组织：可采用4%多聚甲醛固定液 （时间以24小时效果最佳）。
  
• 脑组织：可采用4%多聚甲醛固定液 （固定24小时以上）。
  
• 骨组织：可采用Muller液固定剂或FineFIX固定剂 （骨髓可采用Zenker-甲醛固定液；胎儿指骨可采用Helly固定液）。
  
• 眼球：Bouin’s 液或Kolmer或Verhoeff（甲醛水溶液10ml，95%乙醇48ml，蒸馏水36ml，苦味酸1g，固定48小时）固定液。
  
• 固定糖原的固定剂可采用含高浓度苦味酸 （Bouin液）、乙醇 （无水乙醇）、甲醛溶液（甲醛100m l+自来水900ml+NaCl 9g，先将NaCl溶于水，再加入甲醛。
  
• 冰冻切片，冷丙酮固定10分钟。
  

固定的一般要求

• 固定组织时，应选择合适的容器、一般容器的容积是组织的10～15倍以上。应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5～10倍，最少也不应少于五倍。
  
• 标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液对标本的渗入。
  
• 根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，一般4～12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。
  

脱水



常见组织脱水剂选择

• 实质器官组织如肝、肾、脾、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、淋巴结、腮腺、扁桃体、胸腺、胰腺等，这些器官组织都含细胞丰富，在脱水过程中易产生酥脆现象（细胞过度脱水收缩），所以不适于使用强脱水剂，如无水乙醇，丙酮等，而且在脱水过程中，切忌加热和脱水时间过长。可以使用脱水中性的试剂，如正丁醇、叔丁醇，这样可以保证脱水后这些器官组织不变酥脆。
  
• 心脏、肺脏、子宫、前列腺、肌肉、舌、阴茎、睾丸、卵巢等器官，对脱水剂有较强的抵抗作用，脱水剂对其作用比较缓慢，不易渗透，所以比较适合用较强的脱水剂，如乙醇、丙酮，或乙醇丙酮的混合脱水剂。
  
• 胃、肠、膀胱、血管、输卵管、输尿管、阑尾、胆囊、食管等器官，对脱水剂的抵抗作用没有那么强，但由于这些管状器官是由多层不同组织构成，故而脱水剂的穿透性太弱，效果也不会太好，这里建议以乙醇处理为当，其他的脱水剂效果不甚理想。
  

组织脱水后出现发脆的原因是什么？

• 脱水过度容易造成组织发脆，造成组织发脆的原因还有加温 （温度超过36℃）、脱水剂内加有丙酮。脱水过度引起组织发脆可能是乙醇起始脱水浓度过高引起。
  

淋巴结的具体脱水方法是怎样的？有些什么特殊的要求吗？

• 淋巴结具有组织结构致密、细胞丰富等组织学特点，其外围有致密结缔组织的被膜包绕。淋巴结的这些组织结构特征就决定了其组织制片较其他组织制片相对难度大。最好不要使用太强的脱水剂，如丙酮等，最好使用较为温和的脱水剂，而适当延长脱水时间是最好的办法。
  
• 经典方法：常温80%乙醇 （60分钟）→95%乙醇Ⅰ （60分钟）→95%乙醇Ⅱ（120分钟）→叔丁醇Ⅰ （60分钟）→叔丁醇Ⅱ （120分钟）→叔丁醇Ⅲ （120分钟）。
  

怎样判断是否是脱水出了问题？

• 一种是脱水不足，组织在包埋蜡块中呈现与石蜡硬度不一的现象，结果是虽能切出蜡带，但蜡带中组织不成片，这是因为脱水不净，使得透明剂与石蜡都无法浸入组织当中，故而形成了没有浸蜡的组织蜡块；
  
• 另外一种是脱水过度，组织因为脱水过度 （脱水剂太强，脱水温度过高、脱水时间太长等）致使组织细胞结构发生不可逆的变化，即使透明剂和石蜡都顺利浸透组织，但因组织本身已遭破坏，切出的片子也是很糟糕的，呈现组织细胞碎裂，收缩变形的现象。
  

包埋



石蜡包埋有些什么注意事项？

• 作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求在60℃左右。
  
• 包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。
  
• 包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
  
• 包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
  

包埋过程中组织的定向有什么严格的要求吗？

• 组织的定向应有利于减少切片时组织对刀片的阻力。大多数组织应放平包埋，以确保组织周围的包埋剂对组织有支撑作用。
  
• 需特殊定位的组织：1.管状结构：动脉、静脉、输卵管、输精管——以管腔的横截面为包埋面。2.皮肤、肠管、胆囊和其他上皮活检组织——应垂直于表面取材，包埋方向以最后切到上皮面为准，使上皮层的压缩和变形降到最小。3.肌肉活检组织——切片包括横断面和纵断面。
  

切片

角度设置

• 注意刀的角度和刀刃角使刀刃长时间保持在锋利状态。在切片的时候，将刀片安装于刀架后，调整好刀架的角度 （刀的角度）与切片刀的角度 （刀刃角），一般刀的角度为20°～30°，刀刃角为5°～10°。一般硬的组织，刀刃角增大，不同组织的刀刃角也有所不同，选择适宜组织的刀的角度和刀刃角能最大限度保护刀刃，使刀刃长时间保持在锋利状态。
  

巧用毛笔

• 毛笔不接触刀刃：保证切片时毛笔不接触刀刃是保护切片刀又一个操作细节。
  
• 用毛笔清理切片刀架上的蜡条碎屑时，注意毛笔的方向始终是往上的，也就是从刀架的底部往刀刃方向刷动。
  

刀片粗细分开

• 一方面，粗切和微细切片使用不同的刀片；
  
• 另一方面是同一刀片不同刀面进行粗切与细切。刀片使用的时候，首先从最左边的刀刃开始，这个位置的刀刃变钝后，就只进行粗刀，微细切片的位置选择在相邻的右侧新刀刃上。
  

刀片保管

• 每一次切片结束后，宜把刀片卸下，放入切片刀盒子中。目的是减少刀片暴露在空气中的时间过久刀刃氧化，容易变钝。
  

摇轮

• 切片时摇轮的手法很重要，粗切时可以稍快，但左手进刀量不要太大，以免啃掉大块组织。细切时要慢摇，动作要平稳，那种咣当咣当急摇的现象不可取。
  
• 经验决定切片的速度，但一般应该用平稳缓慢的速度切片。如果在切取平整光滑切面有困难时，在切片过程中用温水暖一下组织表面或对组织块表面轻轻地呼一口气可能有帮助。这样做有舒展组织块的作用，但切片会稍微厚一点。
  

蜡块冰块冷冻

• 细切时，蜡块最好用冰块冷冻一下，有人说要有冷台就不用冰块，太麻烦，但冰块的作用不光是冷冻，它还起到湿润，去除静电的作用，对蜡带的完好保存有益处。
  

展片

• 水温要合适 （42～45℃），不能太高，水温高切片容易漂散，水温过低，切片不易展开，在入水前加一道乙醇 （30%），效果会更好。
  

切片厚度

• 一般我们把切片厚度定在4μm，但一些特殊的组织也要做调整，如脂肪组织就要厚一些，一般在5～6μm；淋巴结、甲状腺等要薄一些，一般在3～4μm。
  
• 有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。
  

切片常见问题与对策

• 1.组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。
  
• 2.切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等。
  
• 3.蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关。
  
• 4.厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。
  
• 5.出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结，也可能会有棉纸纤维等。
  
• 6.切片困难：切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块搅白，主要由于组织处理失败，或切片刀出现问题。
  
• 7.组织内陷：组织脱水不佳，补救办法：可先将蜡块溶解，取出组织，放入加热水浴的丙酮内（80℃），30～60分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。
  

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