必看！免疫组化实验的那些技巧+经验总结

空白派

想拿高分文章，不学免疫组化怎么行?
在科研大世界中，实验方法总是层出不穷，而免疫组化(IHC)作为经典中的经典，自然是科研人员必备的技能之一。
现在，学霸姐姐就把IHC的全攻略分享给大家。
免疫组化实验流程



主要试剂配制
1、1xPBS 缓冲液：秤取 NaCl 8.0g, KCl 0.2 g, Na2HPO4- 12H2O 2.85 g,KH2PO4 0.24 g, 加双蒸水900ml溶解,调pH值至7.4,量筒定容至IL，高温高压灭菌后使用。
2、0.5%Triton X-100：取50ul Triton X-100加入10mlPBS中，然后放入37℃水浴锅溶解。
3、a柠檬酸盐储存液的配制:0.1 MA每升含柠檬酸21 g;0.1 M梓檬酸钠缓冲液B:每升含梓檬酸钠29.4 g。b梓檬酸盐工作液的配制：0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)：每升含A液19 mL、B液81 mL,加蒸馏水溶解,调pH值至6.0,量筒滴定至1L。
实验方法
1、石蜡切片预处理准备
烤片:组织切片入放入65℃-75℃烤箱中烤1.5h;
脱蜡:切片在二甲苯放置10min更换二甲苯在放置10min;
水化:将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇和80%乙醇中、纯化水各5min。
2、切片抗原修复
将切片放入修复盒中加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，两分离开热源自然冷却。弃去抗原修复液,将切片用PBS淋洗。
3、切片的打孔
0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min。
4、消除内源性过氧化物酶
将切片移入湿盒中加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗;
5、非特异性封闭
封闭PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min;
6、免疫反应：
一抗：水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(DDIT3 1：300，，GRP78 1：300、CASP121：200)，放入湿盒，4℃孵育过夜。
滴加兔/鼠二抗工作液，室温孵育1h，PBS充分淋洗;
7、显色复染
DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗1分钟 ;
苏木精复染3分钟，盐酸酒精分化,反蓝;
自来水冲洗1分钟 脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化经验总结
1、石蜡切片和冰冻切片的比较?



2、如何才能充分脱蜡?
1)切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短;
2)脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天室温高，3-5 min 就已足够。如果在冬天，则脱蜡时间需要延长，10-20 min 或更长。
3)当天切的切片，烧烤 2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20 min，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果会更好。
2、一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃复温?
一方面，防止切片从 4ºC 直接放入 PBS 易脱片;另一方面，使抗原抗体结合更稳定。
3、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么?
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。
4、脱片产生的原因和如何防止脱片?
多聚赖氨酸玻片质量的问题、组织切的不好、组织的问题、没烤好、操作的时候甩的太猛了、修复的问题。
免疫组化实验，你学会了吗?
学霸姐姐建议大家把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

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