CRISPR盘点 | 20篇奠基性文章解析（张锋达到5篇）

Rose

“基因组编辑技术”作为生命科学技术发展中的一项突破性技术，实现了针对基因的精准修改。而CRISPR 技术的出现和发展，使基因组编辑技术在原有的ZFN 和TALEN 技术的基础上，变得更加简便和经济，进而在基础究，基因治疗及遗传改良等方面展现出巨大的潜力，在生物技术领域掀起了研究的热潮。经过检索，我们发现，对于引用量最高的20篇文章（非综述类），引用量达到了28112次，占到总引用率（总引用量163759次）的17.17%，但是文章只是总数（文章总数8363篇）的0.2%。故我们主要介绍这20篇文章，以及阐述这20篇文章为什么会有这么高的引用量。

1基本分析

通过检索CRISPR，发现总共有8363篇文章（非综述类），发现总引用次数是163759次，施引文献是43189篇（图.1）。




图.1 CRISPR技术全部文献分析（非综述类）
同时我们看了CRISPR的不同时间的引用情况，我们发现2008年以前，CRISPR几乎没有引用量，但是2012年，引用量迅速达到了4008次；2013年，7470次；2014年，15550次；2015年，30959次；2016年，49513次；2017年，49662次（2017年11月5日统计）（图.2）。这说明CRISPR领域迅速的进入热点，被大家接受。




图.2 CRISPR技术全部文献时间-引用分析（非综述类）

紧接着，我们统计了前20篇文章的引用情况（非综述类），结果令我们大吃一惊。对于前20篇文章，引用量达到了28112次（图.3），占到总引用率的17.17%，但是文章只是总数的0.2%。




图.3 CRISPR技术前20篇文献分析（非综述类）
之后我们看了一下20篇文章不同时间的引用情况，发现2012年，有276次；2013年，1611次；2014年，4246次；2015年，8213次；2016年，7649次；2017年，5499次（2017年11月5日统计）（图.4）。总的来说，这20篇文章占了非常大的引用比率，这说明，这20篇文章是核心及奠基性的文章，我们接着着重细分这20篇文章。




图.4 CRISPR技术前20篇文献时间-引用分析（非综述类）

220篇文章分析


首先，我们首先看了这20篇文章发的时间点，发现2007年，2008年，2012年，只有1篇文章；2011年及2014年，有2篇文章；2013年，集体爆发，有13篇文章（图.5）（其中在2月份，有3篇文章同一时间发表；其中在3月份，有3篇文章同一时间发表；其中在9月份，有3篇文章同一时间发表）。





图.5  20篇文章发表时间统计（非综述类）
然后，我们对于发表文章的杂志进行了分析，发现以下现象（图.6），作者非常的喜欢在Science发表CRISPR的最新成果，达到了7篇；只是是NBT，有5篇；在之后就是Cell，有4篇；这说明这些顶级期刊都抓住了机遇，在各自的杂志上发表，比较均匀。




图.6  20篇文章发表杂志统计（非综述类）

而后，我们对发文国家进行统计，发现美国占了绝大部分，达到16篇，剩下的由荷兰，法国，韩国及瑞典各1篇（图.7）。




图.7  20篇文章发表国家统计（非综述类）
对于研究机构统计分析发现，Broad研究所发表了6篇文章，哈佛大学及加州大学旧金山分校各3篇，剩下的8篇文章被其他8个大学或者是研究所瓜（图.8）。



图.8  20篇文章发表机构统计（非综述类）
最后我们对于这20篇文章，进行通讯作者统计，发现张锋占了5篇，Doudna 3篇文章，Joung有2篇文章。

3为什么20篇文章引用量会这么高（6篇基础研究）




这是2007年的文章，也是第一篇高引文章，Horvath研究组发现，在病毒攻击后，细菌整合了来自噬菌体基因组的新的间隔区序列。 去除或添加特定的间隔区序列，会影响噬菌体的抗性表型。 因此，CRISPR与相关的cas基因一起提供了对噬菌体的抗性特异性作用，故这一篇文章是基础性的文章。





紧接着，2008年发表了在原核生物中小的CRISPR RNA对于抗病毒抵抗至关的重要。原核生物通过将病毒核酸的短片段整合到规则间隔的短回文重复序列（CRISPRs）中获得病毒抗性。 在这里，Oost研究组展示了来自宿主的CRISPR相关（Cas）蛋白质如何使用CRISPR中包含的病毒衍生序列，介导抵抗感染的抗病毒反应。 在CRISPR转录后，称为级联的Cas蛋白复合物在每个重复中裂解CRISPR RNA前体，并保留含有病毒衍生序列的裂解产物。 通过解旋酶Cas3的辅助，这些成熟的CRISPR RNA随后成为使Cascade干扰病毒增殖的小指导性RNA。





2011年，Cebula研究组比较了17个新排序的和表型特征的非伤寒-沙门氏菌肠炎菌株，进行了迄今为止进行最全面的比较分析。这些表型和基因型的数据比较在系统发育物种的背景下表明，已知的肠道亚系统的演变主要是通过两种机制介导：i）具有已知代谢功能的编码序列（CDS）的丧失，其导致功能性减少，ii ）获得水平转移的噬菌体和质粒DNA，其提供毒力和抗性功能，并导致增加专业化。因此，CRISPR分析对于评估肠道沙门氏菌48亚群的进化潜力至关重要，并有助于预测和预防未来的肠道沙门氏菌暴发。这也是第一次对于CRISPR序列进行系统的分析。




CRISPR / Cas系统构成了广泛的一类免疫系统，其保护细菌和古细菌不受噬菌体和质粒的影响，并且通常使用重复/间隔物衍生的短crRNA以序列特异性方式沉默外来核酸。尽管crRNA的成熟代表了CRISPR激活中的关键事件，但是在许多CRISPR / Cas亚型中缺少负责的内切核糖核酸酶（CasE，Cas6，Csy4）。在这里，人类病原体化脓性链球菌的差异化RNA测序揭示了tracrRNA，一种与crRNA前体转录物的重复区域具有24个核苷酸互补性的反式编码的小RNA。Charpentier研究组显示tracrRNA指示通过广泛保守的内源性RNA酶III和CRISPR相关的Csn1蛋白的活性使crRNAs成熟;所有这些成分对于保护酿脓链球菌免受源自噬菌体的DNA是必不可少的。研究揭示了导向RNA成熟的新途径和细菌RNA介导的针对入侵者的免疫所需的宿主因子（RNA酶III）的第一个例子。





基于Charpentier的以上研究结果，Doudna及Charpentier强强联合，进一步阐述CRISPR的基本原理。【通过使用CRISPR RNA（crRNA）指导入侵核酸的沉默，有规律地间隔的短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关（Cas）系统为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。Doudna及Charpentier研究组在这里展示，在这些系统的子集中，与反式激活crRNA（tracrRNA）碱基配对的成熟crRNA形成特殊的RNA结构，指导CRISPR相关蛋白Cas9在目标DNA中引入双链（ds）断裂 。 在与crRNA指导序列互补的位点，Cas9 HNH核酸酶结构域切割互补链，而Cas9 RuvC样结构域切割非互补链。 双tracrRNA：crRNA，当作为单个RNA嵌合体工程化时，也指导序列特异性的Cas9 dsDNA切割。 研究揭示了使用双RNA进行位点特异性DNA切割的内切核酸酶家族，并突出显示利用RNA可编程基因组编辑系统的潜力。】。所以，大家就知道为什么Doudna及Charpentier拿奖拿到手软，那是基于她们阐述清楚了CRISPR的工作原理，这同时也是诺奖级的工作，得奖只是时间的问题。在这之前，张锋还没有爆发，据我们分析，张锋极大的推动了CRISPR技术的应用，这从后续的文章可以看出。

4为什么20篇文章引用量会这么高（14篇应用）












为了争分夺秒，三个研究组同时发表文章，揭示CRISPR在哺乳动物里面的应用，这三个研究组分别是张锋研究组，George M. Church研究组（迫不及待的直接给editor写信，加快审稿过程）【细菌和古细菌已经进化出适应性免疫防御，称为成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关（Cas）系统，其使用短RNA来指导外源核酸的降解。 在这里，Church研究组设计了II型细菌CRISPR系统，在人类细胞中定制特定的指导RNA（gRNA） 。 对于内源性AAVS1基因座，作者获得了293T细胞中10％至25％，K562细胞中13％至8％以及诱导多能干细胞中2％至4％的靶向率。 同时显示这个过程依赖于CRISPR组件; 是序列特定的; 并且在同时引入多个gRNA时，可以影响目标基因座的多重编辑。 另外作者还计算了约190K独特的gRNA靶向〜40.5％人类外显子的全基因组资源。 研究结果建立了一个简单，强大，可反复使用的人类基因组工程的RNA引导编辑工具。】以及Wendell A. Lim研究组（Jennifer A. Doudna也适当的参与）。所以，对于这个领域，手慢则无。总之，这三篇文章，也是第一次把CRISPR使用在人类细胞里面。









由于CRISPR这么好用，尤其是能够同时在Science发表2篇及Cell发表1篇，这为后续的研究开了个好头。很快，就有了3篇Nature Biotechnogy的文章蜂拥而上。这三篇文章分别在细菌，斑马鱼及人类细胞进一步使用，说明这个系统还是非常好用，不会限制物种，细心地读者会发现，这三篇文章中的有一篇，是有张锋参与的。




但是，以上的都是在细胞水平上进行的，Jaenisch研究组（张锋有适当的参与）经过长时间的准备，终于使用CRISPR技术，产生了转基因小鼠，这也是第一次。




其他人，就会想，CRISPR除了能够knock out基因以外，能不能进行knock down。其实这是现实的，通过将Cas9蛋白进行突变，使Cas9缺乏切割的活性，就会抑制基因的表达，这一成果由Weissman研究组发表在Cell上，其中有Jennifer A. Doudna从中的协助。











经过前面的检测，发现CRISPR挺好用，但是其效率，特异性及脱靶率不是很清楚，故这一次同时有3篇文章进行报道。这也是为了进一步优化CRISPR系统，做出了奠基性的一步。













最后，3篇文章呈现了怎么进行基因组编辑，这从单基因编辑迈入了基因组编辑，这极大的推动了CRISPR应用。
总的来说，这20篇文章，极其的出色，但是，我们也不能忽略其他文章所作出的贡献，尤其是CRISPR在其他各个物种的使用，同时CRISPR迈入精确编辑也是一个亮点，另外，CRISPR也可以对于RNA进行编辑，而不仅仅局限于DNA。

20篇文章列表：

• CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes；
  
• Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes；
  
• Comparative Genomics of 28 Salmonella enterica Isolates: Evidence for CRISPR-Mediated Adaptive Sublineage Evolution；
  
• CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III；
  
• A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity；
  
• RNA-programmed genome editing in human cells；
  
• Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems；
  
• RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9；
  
• Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression；
  
• Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system；
  
• RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems；
  
• Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease；
  
• One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering；
  
• CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes；
  
• DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases；
  
• Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity；
  
• High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells；
  
• Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system；
  
• Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells；
  
• Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.
  

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