【病理专题】FISH技术介绍及应用

Rose

asmFISH是基于信号放大的单分子RNA荧光原位杂交技术（Amplification-based Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization )，在多种实验研究中起到重要作用，今天给大家简单介绍一下FISH技术及应用。
asmFISH技术原理

引入一对特殊设计的 DNA 连接探针（DNA ligation probes, DLPs), DLPs 首先与靶标 RNA 通过碱基互补配对杂交；在连接酶的作用下，进行 DLPs 的第一步连接；之后以互补的 DNA 为模板，在 DNA 连接酶的作用下实现 DLPs 的成环反应；随后在 DNA 聚合酶的作用下，进行滚环扩增反应（Rolling Circle Amplification, RCA)，实现对信号的放大；最后在 RCA 产物上杂交带有单个荧光基团标记的检测探针，用荧光显微镜扫描或拍照，从而实现对单个 RNA 分子的原位可视化！
asmFISH检测步骤

• Step 1：DLPs与目标RNA分子上的靶序列杂交；
  
• Step 2：SplintR连接酶将DLPs上与RNA互补的区段连接，形成更长的DNA片段；
  
• Step 3：在T4 DNA连接酶的作用下，以外加夹板为模板，将新形成的DNA片段连接成环；
  
• Step 4：以外加夹板为引物，进行RCA ；
  
• Step 5：最后将用荧光基团标记的检测探针与滚环扩增产物杂交，进行荧光显微镜检，即可完成对单个RNA分子的可视化。
  

asmFISH技术优势

• 单RNA分子可视化、特异性强、灵敏度高、假阳性低；
  
• 可同时检测1~4个靶标RNA；
  
• 应用范围广泛：目标RNA＞100nt即可检测， mRNA、LncRNA、可变剪切、随机序列等多种RNA模板；
  
• 适用于多种组织切片：贴壁细胞爬片、新鲜/固定OCT冰冻组织切片和FFPE切片
  
• 配对短链probe，减少探针碱基合成错误率，避免探针自链，增加透化效率；减少假阳性，增强特异性，提高检出效率；
  
• 每个靶标RNA非保守区设计3~5对探针，可进行有效覆盖；RCA放大信号，具有更高的信噪比；提高检出灵敏度；
  
• 性能稳定、操作方便、设备简单、性价比高。
  

asmFISH样本质控

真实信号点呈现点状，表达量较高时为聚集状态，在DAPI周围；不会有特别的形状。



左图：UBC（阳性探针，橙色）结果，DAPI（蓝色）        右图：dapB（阴性探针，绿色）结果，DAPI（蓝色）20×物镜         图片来源：德运康瑞官网  

asmFISH检测应用

点突变、可变剪切的检测

对于点突变、可变剪切以及高度同源序列翻译产物的检测，因无法生成有效抗体从而无法在蛋白水平进行原位检测；此外，受体-配体的相互作用，刺激或减弱关键的信号通路，而自分泌和旁分泌的信号通路可能定义不同的癌症亚型，这些信息只能通过RNA检测来可视化定位。



数据来源：内部检测项目，使用德运康瑞厂家asmFISH试剂盒

肿瘤生物标志物、肿瘤微环境检测；
免疫与免疫治疗、免疫微环境检测；
神经研究领域Marker、GRCR、神经激活与可塑性研究等；
病毒、病毒与宿主相互作用，如HPV、HIV、AAV、溶瘤病毒等；
干细胞标记与干细胞微环境；
基因治疗、CART安全性评估、TCR-Tcell等多种细胞治疗；
模式生物、小物种相关基因检测等。

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