[测序仪原理] 三代测序：道路千万条，不走PCR （1）：PacBio SMRT

幸福侠侣

讨论第三代测序技术之前，我们先来回顾一下二代测序们的共同特点：他们都有一个绕不开的PCR扩增步骤。
在PCR扩增过程中，很有可能会产生碱基的错配，产生本不存在的SNP，使得疾病检测中很多的稀有突变被视为测序误差。同时为了防止扩增过程中错误的大量积累，二代测序的读长受到了限制。
由于很难控制各个reads 都处于同一扩增水平，会造成不同区段内的覆盖度不同，同一个片段可能被过量扩增导致其受到多次测序，造成冗余。
三代测序绕过了PCR扩增步骤，直接使用目标序列作为模板进行单分子测序，可以直接获得完整、覆盖度均一的测序结果。
测序仪原理系列笔记将以三代测序进行收尾，第一篇从Pacific Biosciences 的 SMRT技术开始。

原理
SMRT 全称为 Single Molecule Real-Time，也就是单细胞实时测序技术，它运用的依旧是边合成边测序的思想。


SMRT 测序使用的Cell 是一张厚度为100 nm的金属片，一面带有几十上百万个直径为几十纳米的小孔，称为零模波导孔（zero-mode waveguide，ZMW）。
在纳米孔底部，锚定着测序模板（DNA单链）和DNA聚合酶，同时包含着四种被不同荧光基团修饰的dNTP。由于每次添加的dNTP所携带的荧光颜色是不同的，在激光的激发下可以发出不同的荧光，根据散射出的荧光信号可以判断添加的碱基类型。
激光从ZMW的下方进入，由于ZMW的直径小于激光的波长，检测激光会被限制在纳米孔内部，不会进入小孔上方的溶液区，干扰临近ZMW的测序；被激发的荧光也只会从ZMW下方的玻璃散发，被检测器检测。
DNA聚合酶介导的延伸反应会沿着一个方向进行，在下一个dNTP添加之前，前一个dNTP上的荧光基团会从复合物上脱落下来，所以单独的一个碱基检测到的荧光信号只会持续很短的一段时间，根据检测到的不同波长和峰值以及他们之间的间隔，就可以得到和模板序列配对的序列信息。
基于这一原理，PacBio开发出了三款三代测序产品：PacBio RS ，PacBio RS II 和 PacBio Sequel

优势

• 超长的读长：PacBio RS II 的平均读长为10-15kb，PacBio Sequel 可以达到 8-12kb。
  
• 高一致性准确度：SMRT 的错误是随机发生的，而非二代测序的偏好性错误。虽然原始数据的准确度很低，但随着测序深度的增加，这些随机性错误可以被排除掉，30X的准确度可以达到99.999%。
  
• 均匀的覆盖率：SMRT不需要扩增过程，所有片段的覆盖率均相同。
  
• 可直接检测碱基上的化学修饰：在通过DNA聚合酶的时候，有化学修饰的碱基的通过速度较慢，这种减慢可以反应在荧光信号的间隔上。
  
• 单分子分辨率：因为测序模板为单独的DNA链，因此可以用来区分相似序列之间的区别。
  
• 测序速度快：SMRT具有很高的测序速度，每秒可以测10个碱基。
  
• 原始DNA不被破坏：不再像鸟枪法那样打断DNA序列，省去了拼接和组装过程。
  

劣势

• 原始数据的错误率高，需要重复测序降低错误率。
  
• 贵！太贵了！SMRT的成本是二代测序的6-7倍。
  
• SMRT测序依赖于DNA聚合酶的活性，但DNA聚合酶的活性会受到检测激光的影响。
  

参考：
三代测序技术简介 - Ryann'sBio - 博客园
SMRT Sequencing - PacBio
三代基因组测序技术原理简介 - helixminer - 博客园

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/56796815