[测序仪原理] 基因组学的起点——一代测序（Sanger sequencing）

HaHa

*测序仪原理与测序原理不一样，测序原理其实是不同测序的建库原理，通过不同的建库方式得到目标序列。无论什么测序，最后进入测序仪的都是DNA序列，测序仪原理部分就来讲讲这些测序仪是怎么工作的

第一代测序由英国的生化学家，弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）发明，因此也被称为桑格法测序。桑格法测序是基因组学的开端，有了高效的测序方法，人类才大规模地能够了解整个基因组上所携带的信息。
正常的PCR反应，需要添加dNTP作为合成材料，相邻的两个脱氧核苷酸之间通过形成磷酸二酯键，使得新合成的DNA按照模板不断延伸。
第一代测序基于PCR反应，在反应体系中掺入了一定量的ddNTP，ddNTP不含3'-OH，无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键，DNA链终止延伸。


dNTP与ddNTP的区别
理论上来说，在任意一个位点都可能由于ddNTP的掺入导致合成终止，产生一个短片段，但实际上模板的长度会影响测序的质量，越长后面的结果越不明显。
以掺入ddT为例：


我们能够从掺入ddT的PCR反应中得到两种以ddT结尾的短片段，并从电泳结果中得到ddT在DNA链上的位置。
在同一个样品的PCR反应中，通过掺入不同的ddNTP，结合电泳结果，就能知道样品的序列了：




在使用荧光信号标记ddNTP后，可以直接通过检测荧光信号得到整条序列信息，一代测序仪也是通过检测荧光信号来实现自动测序的。
典型的例子是ABI的测序仪，使用注入丙烯酰胺溶液的毛细管代替琼脂糖电泳，丙烯酰胺溶液在紫外线电离作用下，在毛细管内形成细小的丙烯酰胺凝胶，并在毛细管两端加电压进行电泳，通过激光检测荧光信号，来得到序列信息：


ABI 3500
一代测序的特点：
相对于二代测序来说，读长较长。
极为准确
测序成本高
通量低

题图为人类基因组计划，向当年用一代测序完成人类基因组测序的科学家表示致意。
在人类基因组计划中，我国参与了并完成了人类3号染色体短臂上一段约30Mb的测序任务。

参考：
动图演示一代测序过程：
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/50107050