【核酸提取9】细菌DNA提取方案

非诚勿扰孟非

细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。

一、水煮模板法——主要用于PCR反应

1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18－24小时。

2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。

3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，－20摄氏度保存备用。

操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。

有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。

二、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,

2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;

3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。

4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。

5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。

7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。

10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。

CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot。
编者建议：长时间保存DNA可放于-20℃，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。

三、盐析法

1、1.5ml对数期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min

5、上清用粗枪头取至新管

6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层

7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min

8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇

9、-20C，20min，14000rpm， 15min

10、400ul 70%冷乙醇洗涤

11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min

12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤

13、干燥，溶于100ul TE

介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。

革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。

实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！

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