生命科学新篇章：空间蛋白组学的新时代探索

空白派

概 述

在生命的微观舞台上，蛋白质扮演着关键角色，它们不仅需要被制造出来，更需精确地被运送到正确的亚细胞位置，以便发挥其生物功能。这一过程，如同精心编排的舞蹈，每一个步伐都至关重要。
想象一下，蛋白质在细胞中的定位与运动，就像一幅动态的画卷，每一笔都描绘着生命活动的重要细节。捕捉这些细节，并理解它们的动力学变化，是解锁细胞生物奥秘的关键。如今，随着显微技术、质谱分析以及机器学习等先进工具的加持，我们对蛋白质在空间上的分布和调控有了更深入的认识。
这项研究的意义远不止于此，它让我们能够以前所未有的方式动态描述基因调节，揭示基因表达的调控机制，定量衡量蛋白质水平，甚至识别疾病和药物对生命过程的影响。空间蛋白质组学，正成为我们解读生命密码的一把钥匙，开启对细胞世界深度认知的新纪元。

技术原理


随着技术的不断创新和进步，空间蛋白组学技术已经变得更加灵活、高效，提供了更丰富的信息来研究蛋白质在组织和细胞水平的空间分布和相互作用。目前，主要的空间蛋白组学技术原理包括以下几种：

首先，免疫组织化学（IHC）是最早应用的技术之一，它使用特异性抗体与组织中的目标蛋白质结合，并通过染色反应可视化目标蛋白质的位置和表达水平。其次，免疫荧光染色（IF）是在免疫组织化学基础上的进一步发展。它利用荧光标记的抗体来标记目标蛋白质，通过荧光显微镜可视化蛋白质的空间分布。IF技术具有高灵敏度和多色染色的能力，因此成为研究蛋白质亚细胞定位和相互作用的重要工具。

另外，原位质谱成像（IMS）结合质谱分析和组织切片，可以在原位对组织中的蛋白质进行定量分析和成像。IMS技术的发展使得可以在组织中实现更高的空间分辨率和更准确的蛋白质定量。

然而，这些技术都主要依赖于抗原抗体结合的方式，在研究细胞异质性、疾病发生机制等领域存在局限性，更多地用于靶向检测关注的目的蛋白空间分布及验证。而要进行大规模高深度的蛋白质检测分析则有些无能为力。

质谱与激光显微切割技术结合的空间蛋白质组学技术正好弥补了这一空白。基于此可以实现对病理切片中特定空间位置组织微环境（如单细胞空间定位、组织结构等）在成像及蛋白表达等层面进行系统的定位、定性和定量分析，单个样本检测深度可达数千个蛋白。这为揭示组织微环境高度异质性、不同细胞类型的空间分布、细胞间信号转导网络关系，以及对癌症等重大疾病的发展机制研究提供了重要的分析工具。




图2. 空间蛋白组学基本原理



技术分类


空间蛋白组根据研究目的的不同分为空间非靶蛋白组和空间靶向蛋白组。

01 空间非靶向蛋白组

目前空间蛋白组应用原理最简单，最广泛的方法是关注切片中的哪一个部分，就使用激光捕获显微切割技术（LCM）切割组织切片中感兴趣区域，再提取蛋白质用微量质谱方法检测和分析。

空间蛋白质组学技术，运用LCM技术在显微镜直视下从器官或组织切片中，按照指定的圈画区域准确获取某个特定的细胞群，其分辨率高至0.005~0.01mm^2（约50个细胞）。通过细胞级的精细切割，和稳定无污染的收集，保障了空间蛋白质组研究的精细度和准确性，允许研究人员在组织样本中精确地定位和采集感兴趣的细胞区域。



图3.高精度激光捕获显微切割技术 (LCM)结合质谱

IMS（质谱成像技术）是一种高度敏感的分子成像技术，其传统形式基于基质辅助激光解吸电离质谱仪（MALDI-MS）。在这种技术中，微米级的激光束被照射到预先制备的组织样品上的金属基板上。当激光点击中的分子被电离并进入质谱分析仪进行肽段识别时，光栅扫描同时生成组织图像，并记录点的位置与相关质谱数据。尽管IMS技术能够在几十微米的分辨率下同时分析几十至一百种蛋白或多肽片段，但由于通常需要依赖HE组织染色来指导需要解析的兴趣区域（ROIs），并受制于其分辨率，因此很难对特定的亚组织结构进行精确的剖析。此外，作为一种非偏倚的质谱蛋白组学技术，IMS无法对特定区域中的特定兴趣靶点进行基于密度距离的精确定量分析，在靶向药物与免疫药物结合研究中尤其难以发挥作用。



图4. IMS技术原理示意图

02 空间靶向蛋白组
空间靶向蛋白组是以预先确定的蛋白质列表为检测对象，常见方法的原理包括基于测序、抗体富集和金属标记三种技术原理。

基于测序的空间蛋白组技术比较常见的就是GeoMX DSP（Digital Spatial Profiler）
技术，其核心特点是为每种抗体添加了特异性的寡核苷酸标签。相比传统的荧光标记循环成像技术，GeoMX DSP利用紫外光释放标记在抗体上的特异性寡核苷酸标签序列，然后通过nCounter读数定量来收集这些标签。此技术不仅免去了荧光基团的使用，还能够对组织切片进行多重免疫荧光的预处理，提前展示切片的形态学特征。用户可以选择目标关注区域进行针对性的蛋白表达特征检测，单个区域的细胞数量可低至5-10个，这极大提高了研究效率。目前，该技术已经能够检测近100种蛋白，涵盖了肿瘤、免疫和神经相关的功能蛋白。

基于荧光成像的空间蛋白组技术比较有代表性之一是美国AKOYA公司开发的CODEX（Co-detection by indexing）单细胞蛋白组学分析平台。CODEX的核心设计包括两个关键部分：检测试剂和成像试剂。

具体工作流程如下：首先，将检测试剂与组织孵育，实现barcode-抗体-靶标蛋白的特异性结合；接着，加入成像试剂，使荧光探针与barcode-抗体-靶标蛋白特异性结合，通过荧光成像分析靶标蛋白的空间分布及相对丰度。成像试剂分批次加入，每次加入3种，成像后在温和条件下洗脱荧光标记物，完成一个检测循环，重复循环直到检测完所有靶标。最终，通过图像处理系统获得单细胞高分辨率蛋白空间分布图。



图5. CODEX工作流程示意图

CODEX的优势在于可以达到单细胞级别分辨率，获得空间单细胞蛋白图谱。然而，由于荧光基团数量和循环效率的限制，能够检测的靶标数量有限，目前检测上限在50个左右。

基于质谱的空间蛋白组技术中，IonPath 公司的 MIBI（multiplexed ion beam imaging）多离子束成像技术是一个典型代表。与 CODEX 不同，MIBI 利用金属同位素标记抗体。首先，待标记的抗体与组织孵育后结合，随后使用离子光束释放抗体结合的同位素。接着，通过飞行时间（TOF）质谱对同位素分子进行定性定量分析。最终，将检测结果与单细胞分辨率图像合并，以获得高清空间蛋白表达图谱。



图6. MIBI技术原理示意图



技术比较


空间蛋白组学技术是一组用于研究蛋白质在组织和细胞水平的空间分布和相互作用的技术。以下是几种常见的空间蛋白组学技术的比较，这些技术各有特点，适用于不同的研究目的和实验需求，选择合适的技术取决于研究对象、研究问题以及实验条件等因素。

表1. 不同空间蛋白组学技术比较




应用


空间蛋白组学技术在生物医学和生命科学领域广泛应用，涵盖多个重要领域。它有助于揭示肿瘤微环境中蛋白质的空间分布和相互作用，深化对肿瘤发展、转移和耐药机制的理解，并为个性化治疗提供依据。通过空间蛋白组学的研究也可以帮助鉴定和定量组织中的生物标志物，为疾病诊断、预后评估和治疗监测提供支持。

除了在基础研究中的应用，空间蛋白组学技术在药物研发领域也发挥着重要作用。通过研究药物与蛋白质的相互作用和定位，可以评估药物的效力和特异性，优化药物设计和筛选过程，从而加速药物研发过程，提高药物的疗效和安全性。

总的来说，空间蛋白组学作为新兴领域，为研究组织微环境的异质性、不同细胞类型的空间分布以及细胞间信号转导网络关系提供了全新的视角。通过应用空间蛋白组学技术，我们可以更深入地了解蛋白质的功能、相互作用以及在生物过程中的作用，为生命科学研究和医学应用提供了重要的支持。

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