血浆DNA的提取难点及常见问题

非诚勿扰孟非

一、血浆游离DNA提取难点
血浆样本中游离DNA（cfDNA）是复杂的混合物，包含崩解的白细胞、坏死的肿瘤细胞和病原体的DNA，健康人血浆中只含有少量的游离DNA，片段大小主要在200bp以下。目前，游离DNA已作为新的生物标志物用于临床孕妇产前诊断、肿瘤检测、器官移植术后检测和病毒感染检测等领域。其提取难点主要在于血浆样本中游离DNA含量一般较低，片段较小。
二、血浆游离DNA提取常见问题
1.血浆DNA提取出来测得的浓度很低是不是意味着提取失败？
No!首先，血浆样本中游离核酸含量本就很低，根据某国际权威公司数据，1mL血浆样本DNA提取得率只有7.35ng左右（图1）。



图1 某国际权威公司关于cfDNA得率的数据图

其次，采用nanodrop等基于紫外分光光度计测得的浓度，实际上是很不准确的，因为这些样品中DNA含量过低，已经接近分光光度计的最低量程，且多次测量的结果会变异很大。因此可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。



图2 Biog血浆DNA提取试剂盒做血浆样本DNA提取，Q-bit测浓度无读数，PCR检测结果靶基因（CT 25左右）以及内参（CT 21左右）扩增曲线。

2.如何提高血浆DNA提取得率？
方法1：使用BIOG专用的血浆DNA提取试剂，裂解液可高效解离血浆蛋白与DNA的粘结，洗涤液A能够充分洗涤去除血浆蛋白、脂质和色素等的污染；
方法2：建议选用BIOG中大量血浆DNA提取试剂，普通血浆DNA提取试剂只能提取0.2mL血浆中的cfDNA，而BIOG中大量血浆DNA提取试剂可提取1mL以上血浆样本中的cfDNA。
三、血浆游离DNA提取步骤流程简化示意图
配制洗涤液→血浆样本裂解→DNA析出→DNA吸附→杂质洗涤→DNA洗脱与收集
几点提示：
1）由于血浆中含有大量血浆蛋白，极易对血浆DNA提取造成污染，最好选用含有高效去污因子的BIOG洗涤液A，以高效去除血浆蛋白、脂质和血色素等。
2）由于血浆cfDNA与蛋白质紧密粘附结合，最好选用能够充分解离蛋白质和DNA的高效血浆样本裂解液，如BIOG裂解液等。
3）配制洗涤液时一定要充分混匀，否则会影响洗涤效果，建议现配现用哦~

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