你真的搞懂测序技术了吗 ——第二代测序

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之前我们讲了测序以及第一代测序技术，还没看的小伙伴可以先去补补课  你真的搞懂测序技术了吗——测序、第一代测序。今天我们接着讲第二代测序技术。
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上回我们说到，Sanger测序的缺点主要是速度慢和成本高，为了解决这些问题，新的测序技术应运而生。既然最先出现的Sanger测序是第一代测序，那么之后出现的就只能依次称为第二代、第三代测序或者是下一代、下下代测序了，不得不说，这个命名方式也有点过于直白了。
第二代测序技术又称下一代测序技术（next generation sequencing, NGS），由于通量高——一次测序能读取成千上万个短DNA片段（Sanger测序一次只能测一条DNA片段），又被称为高通量测序技术（high throughput sequencing, HTSeq）。
目前市场上主流的二代测序仪有很多，比如Illumina测序仪、罗氏454测序仪、还有国产的华大智造测序仪等，每种测序仪都有其比较独特的测序原理，这里我们以介绍市场占比最高的Illumina测序仪为主，其主要包括文库制备、桥式PCR扩增、测序三个步骤，具体如下：

1.文库制备
1）将待测DNA随机打断为一定长度的片段（如图1）。



图1

2）对片段的两个末端进行处理，如图2所示，最终产生的每条DNA单链的5’端均连有P7、index、Rd2SP（Read2 Sequencing Primer），3’端均连有P5和Rd1SP（Read1 Sequencing Primer），这些DNA单链即组成样品文库。



图2

这里就需要解释一下P5/P7、index、Rd1SP和Rd2SP分别是什么了。
P5/P7：Illumina测序使用的微阵列芯片叫做流通池(flow cell)，其表面固定了无数条寡核苷酸链（P5’,P7）,分别可以与P5、P7’互补结合。这样，当样品文库中的DNA单链进入流通池后，就通过其3’端的P5结合到了附着在流通池表面的P5’上。
index：我们知道第二代测序是高通量测序，一次测序能读取成千上万个短DNA片段，当这些片段来自不同的样本时我们该如何区分呢？那就给来自不同样本的DNA片段添加上一段不同的序列，有序列A的就是来自A样本的DNA片段，有序列B的就是来自B样本的DNA片段，像A、B序列这种用于区分来自不同样本的DNA片段的标签序列就叫做index。
Rd1SP和Rd2SP分别是第一轮测序引物和第二轮测序引物。为什么需要两轮测序呢？第二代测序有单端测序、双端测序，顾名思义，单端测序就是只从一端读取DNA的序列（→），双端测序就是从两端相向读取DNA的序列（→←），那自然就需要在待测DNA的两端都加上引物了。
2.桥式PCR扩增
1）前面我们提到，样品文库中的DNA单链进入流通池后，就通过其3’端的P5结合到了附着在流通池表面的P5’上。由于样品文库经过稀释后浓度足够低，因此，可以认为各DNA单链均匀的结合在流通池表面，且相距足够远（图3）。



图3

底部带有黑色横线的序列代表附着在流通池表面
2）以其中一条DNA单链为例，在适宜的条件下，以P5’为引物、文库DNA单链为模板进行复制后，洗去文库DNA单链，就获得了一条附着在流通池表面的DNA单链（如图4）。



图4

3）进行桥式PCR：
①新合成的附着在流通池表面的DNA单链弯曲，其3’端的P7’与流通池表面的P7互补结合，在适宜的条件下，以P7为引物，弯曲的DNA分子为模板进行复制（如图5）。



图5

②附着在流通池表面的DNA单链再弯曲与P5’或P7互补结合，再进行复制（如图6）。



图6

③25-28个循环后，原来散布在流通池表面的文库DNA单链变成了DNA簇，为保证同一簇内只有一种DNA单链，以及为了先从Rd1SP开始测DNA的序列，因此，先把P5’上的DNA链切割并洗脱，只保留P7上的DNA链，这样在flow cell表面就形成了数以亿计的DNA分子簇（cluster），每个cluster是具有数千份相同模板的单分子簇（如图6）。为什么要把DNA单链扩增为DNA簇呢？我们后面再回答。



图7

3.测序
1）加入能与Rd1SP互补结合的引物Rd1SP’，DNA聚合酶，以及特殊的dNTP（带有阻断基团，当被添加到DNA末端时可阻断延伸反应；4种dNTP带有4种不同的荧光基团可发出不同的荧光信号），在适宜的条件下，开始测序（如图8）。延伸（阻断基团使反应终止）→洗掉多余的dNTP→扫描添加到DNA末端的dNTP发出的荧光信号[后续再通过分析就能知道这个位置添加上的是哪种dNTP，这就是边合成边测序（sequencing by synthesis， SBS）技术]→切去荧光基团和阻断基团，再加入反应物，又可以继续延伸（这就是可逆终止技术）→洗掉......→扫描......→......，如此循环，把每个位置添加上的碱基都测出来，拼在一起就是这条DNA的序列。完成第一轮测序，洗去合成链。
看到这里关于为什么要把DNA单链扩增为DNA簇这个问题你应该已经有答案了——使单链的DNA复制转换为多条相同链的同步复制，从而放大光信号。但是随着复制的进行，cluster中各个DNA分子复制的协同性降低，因此，第二代测序的缺点就是读长短。



图8

2）再加入Rd2SP’（如图9），测出index的序列，洗去。



图9

3）再进行桥式PCR，这次保留P5’上的DNA链，进行第二轮测序，加入Rd2SP，这次从Rd2SP开始测DNA的序列，实现双端测序（如图10）。



图10

小结
①第二代测序技术又称为下一代测序技术、高通量测序技术。
②illumina测序是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即flow cell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在flow cell 上形成了数以亿计cluster，每个cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性终止的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序③优点：速度快、成本低、通量高、准确性高。缺点：读长短。

好了，
测序技术的系列文章就更到这了，
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