基因编辑-载体构建之CRISPR/CAS9

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基因编辑技术是指通过核酸酶对靶基因进行定点改造，实现特定DNA的定点敲除、敲入以及突变等，最终下调或上调基因的表达，以使动植物、细胞等获得新表型的一种新型技术。

目前基因编辑技术主要包括：
（1）锌指核酸酶技术(ZFN)；
（2）转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALEN)；
（3）规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR) 。‍
目前，CRISPR-Cas9系统应用最为广泛，可对基因组DNA进行编辑，Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂，并启动DNA损伤修复机制。CRISPR-Cas9技术在靶点验证、药物分子的高通量筛选、遗传性疾病的治疗等领域得到了广泛的应用。



eSpCas9

上图为CRISPR基因编辑实验中常用的载体。eSpCas9（Enhanced specificity SpCas9），增强特异性SpCas9（eSpCas9）也称为SpCas9（K848A/K1003A/R1060A），提高了Cas9蛋白对靶点基因的特异性，由Broad研究所张峰实验室构建（Slaymaker et al.2016）。eSpCas9能够减少超过10倍的对目的基因的脱靶效应，同时保持对靶基因强大的编辑效率。它主要包括以下几个部分:
1. ori：ori是origin的缩写，它是DNA序列上固定的复制起始点。ori对于宿主扩增质粒的能力至关重要。
2. U6 promoter：U6启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，一般位于转录起始位点上游。U6启动子，属于真核生物RNA聚合酶III，无物种特异性。
3. CAG enhancer：CAG增强子是DNA上一段能与蛋白质结合的区域。与蛋白质结合后，基因的转录作用会增强。
4. FLAG：FLAG标签，适用于基于抗体的亲和纯化。
5. Cas9：Cas9核酸内切酶，该载体上的Cas9蛋白是SpCas9即来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR/Cas系统，同时经过突变提高了靶向特异性。另外一种广泛使用的Cas9蛋白是来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus）的SaCas9。
6.bGH poly(A) terminator：bGH是真核生物mRNA3'端的加尾信号，用于转录终止，该信号终止较弱。常用的转录终止子还包括SV40、hGH、rbGlob等，终止转录信号较强。
7. f1 ori：f1噬菌体复制起始位点，其箭头所指方向为链合成方向。
8. AmpR promoter：氨苄抗性基因的启动子
9. AmpR：氨苄抗性基因
CRISPR-Cas9基因编辑载体构建
在植物中进行基因编辑通常需要同时构建Cas基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas 基因的表达通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II启动子驱动，以Nos终止子或其他终止子终止；sgRNA表达盒比较小，一般由长约300 bp的U3或U6等RNA聚合酶III启动子驱动，以连续6个以上的T碱基终止即可。目前常用的基因编辑载体骨架所有的元件都已构建好（包括Cas基因表达盒和sgRNA scaffold），只需连入与靶位点配对的那一段sgRNA即可。设计合理有效的sgRNA是基因编辑的关键。
下面以人类CD28基因为例手把手教大家如何设计sgRNA靶点。
1. NCBI分析靶基因信息
关注基因的转录本 ID、转录本数量、外显子数量及长度、翻译起始位点等信息。
NCBI网址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
操作提示：第一步，打开NCBI，网址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/，选择Gene，输入基因名称物种：CD28 HUMAN，点击Search（见图1）；第二步，点击第一个基因（见图2）；第三步，下拉至转录本图形区，了解常用Genbank数据命名形式: NM_标准的编码转录本；XM_预测的编码转录本；XR_预测的非编码转录本；NR_标准的非编码转录本；NC_、NG_、AC为基因组序列。方框表示外显子，深绿表示编码区，浅绿表示非编码区。图形区可知该基因有3个标准的编码转录本，3个预测的编码转录本（见图3）。



图1



图2



图3

2. 确定靶区域并获取序列
挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域，不影响其他编码基因表达；尽可能敲除所有转录本，敲除位点建议在编码区的前1/3，且避免敲除ATG所在的位置，确定待设计靶点的外显子。
操作提示：第四步，针对转录本同源区以最短转录本NM_001243078.2为例打开转录本序列，复制NM_001243078.2用snapgene软件打开，点击Import，然后点击NCBI Sequence。输入NM_001243078.2，点击Import（见图4）；第五步，点击Sequence，复制第一外显子区域的序列（见图5）。



图4



图5

3. 设计sgRNA
以常用的张锋实验室CRISPOR设计网站为例，点击“CRISPOR”， 填入待设计的外显子序列、选择对应的物种、Cas9类型，设计靶点。（其他设计工具，如Benchling设计流程请点击查看。https://zhuanlan.zhihu.com/p/555063579）
网址: https://zlab.bio/guide-design-resources
操作提示：第六步，打开张锋CRISPOR设计网站，点击CRISPCR。粘贴第一外显子序列，选择物种human和Cas9类型 ,以spcas9为20 bp+NGG(PAM)为例，点击SUBMIT（见图6）。



图6

4. BLAST比对靶点特异性
挑选高评分靶点，进行NCBI-blast，Blast结果分析，Max score完全匹配唯一， 在其他位置至少错配3个碱基，确保靶点在基因组特异性。
操作提示：第七步，选择特异性评分在70以上，预测有效性值越大越好，选择排序前面的靶点（见图7）；第八步，复制靶点序列，打开NCBI Blast网站，和基因组数据库比对靶点特异性，选择物种human。输入序列，点击Blast（见图8）。结果显示，第一个完全匹配20个碱基，第二个匹配17个碱基错配3个，表示该靶点在基因组完全匹配一个，特异性良好。



图7



图8

在关键的的靶点筛选这步结束之后，接下来就要进行基因编辑载体构建。在构建载体前，应根据实验目的选取合适的表达质粒。比如进行实验考虑是否需要reporter标签，是否需要药物筛选基因等。首先直接合成含有酶切位点、载体同源序列及20bp的sgRNA靶标序列和其反向互补序列；合成的sgRNA正反向碱基（摩尔浓度为100 μM）进行退火，使之碱基配对并形成双链结构；选择合适的酶切位点进行酶切质粒，并对酶切后的载体进行回收；将退火配对后的sgRNA碱基与回收后的载体进行连接。连接产物进行转化，氨苄抗性固体培养板进行涂板；挑取单克隆菌落，扩大培养后提取质粒，并使用通用引物对连接载体进行测序，检测sgRNA碱基片段是否正确插入载体质粒。
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参考资料：
1. Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F (2016) Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351:84–88
2. 基因编辑的原理和载体结构https://zhuanlan.zhihu.com/p/580170374

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/667679670