原位杂交ISH实验流程

莺歌燕舞

原理简介：
原位杂交技术（in situhybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
可以检测cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各种种属的标本，包括哺乳动物、爬行动物、菌、植物标本。也可以检测组织芯片。
注：为了提高检测的成功率，请在取材前跟公司业务员联系，确认取材、固定、包埋要注意的事项。
样品保存：
RNA 保存：
RNase 酶的存在使 RNA 保存变得困难。此酶广泛存在于玻璃器皿上、试剂中以及操作人员身上及衣服上。RNase 可迅速破坏细胞中的 RNA 及 RNA 探针本身，因此用户的实验过程、手套和溶液需要保证无菌，防止探针或组织 RNA 受到 RNase 的污染。
冷冻切片的一般样品保存：
为了使保存的载片获得最佳结果，请勿将载片在室温环境下干燥保存。正确方法是，将其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存，或将其用莎伦包装膜覆盖的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C条件下保存。这种保存方法可使载片保存数年。
探针选择：
RNA 探针：
RNA 探针长约 250–1500bp；长度为800bp左右的探针具有最佳灵敏度和特异性。转录模板应支持探针（反义链）和阴性对照（正义链）RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探针之前，必须对环状模板进行线性化，但也可使用 PCR 模板。
DNA 探针：
DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比，DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列，则可据此设计高度精确的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去，可能无法正确检测。





实验方案举例：
地高辛(DIG)标记RNA探针原位杂交实验方案
此方案介绍了如何使用DIG标记的RNA单链探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。
1) 脱蜡
如为冷冻切片请从第 2 步开始操作。
如为甲醛固定的石蜡包埋切片，请继续此步骤。
首先，对载片进行脱蜡和复水操作。如果石蜡去除不完全，则会导致切片的染色效果较差。
将载片置于支架上，然后执行以下洗涤操作：
二甲苯：2x3 分钟
1:1 的二甲苯和100%乙醇：3 分钟
100%乙醇：2x3 分钟
95%乙醇：3 分钟
70%乙醇：3 分钟
50%乙醇：3 分钟
使用冰冷的自来水清洗
抗原修复步骤之前将载片置于自来水中。从这一步开始，不能使载片干燥，因为干燥会导致非特异性抗体结合和高背景染色。
2) 抗原修复
将含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris预热并在37 °C条件下孵育酶解10–20分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓度可能需要根据实际情况优化。
我们建议通过蛋白酶 K 滴定实验来确定最佳条件。酶解不充分会导致杂交信号降低，过度酶解会影响组织形态，给杂交信号的定位带来极大困难。蛋白酶 K 的最佳浓度会随组织类型、固定时间和组织大小而发生变化。
3) 使用蒸馏水清洗载片5次。
4) 将载片浸入预冷的20% (v/v) 乙酸中20秒。这样可使细胞通透化，使探针或抗体能够透过。
5) 分别使用70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇洗涤载片（每次约1分钟）使其脱水，然后风干。
6) 向每个载片中加入 100 µL 杂交液。



盐溶液 (20x)
4 M NaCl
100 mM EDTA
200 mM Tris-HCl pH 7.5
100 mM NaH2PO4.2H2O
100 mM NaH2PO4.2H2O
丹哈德溶液 (100x)
10 g聚蔗糖
10 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）
10 g 牛血清白蛋白 (BSA)
500 ml无菌 dH2O
7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用杂交液稀释探针。利用PCR仪在95 °C条件下加热RNA 或DNA 2分钟，使其变性。然后立即将探针置于冰上冷却，以防止重退火。
9) 除去杂交液。向每个切片加入50–100μl探针稀释液，覆盖整个样品。在 65 °C 条件下在增湿的杂交盒中孵育过夜。用盖玻片盖住样品，以防样品蒸发。
在此步骤中，RNA 探针会与相应的mRNA杂交，或DNA探针会与相应的细胞DNA杂交。杂交温度的优化取决于所用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。
探针的最佳杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。
10) 严格洗涤
通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。
配制 1 L 20x 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)
175.3 g 氯化钠 (3 M)
88.2 g 柠檬酸钠
800 mL 无菌水
使用柠檬酸将 pH 调节为5，定容至1 L 并使用高压灭菌器进行灭菌处理
洗涤 1
50% 甲酰胺的 2x SSC
3x5 分钟，37-45 ℃
在较高温度（高达 65° C）下短时间洗涤，洗去多余的探针和杂交缓冲液。如果洗涤时间过长，则会洗掉大量的杂交探针 RNA/DNA。
洗涤 2
0.1–2x SSC
3x5 分钟，25-75 ℃
此步骤会消除非特异性和/或重复性 DNA/RNA 杂交。
按照以下说明对严谨洗涤的温度和盐浓度进行优化：
· 对于极短的DNA/RNA 探针 (0.5–3 kb) 或极为复杂的探针，洗涤温度应更低（最高45 °C）且严格度更弱 (1–2xSSC)。
· 对于单基因座或较大的探针，温度应在65 °C 左右且严格度应较强（低于0.5x SSC）。
· 对于重复性探针，温度应达到最高且严格度应达到最强（例如 α-卫星重复序列）。
11) 在室温下使用 MABT（含 Tween20 的马来酸缓冲液）洗涤两次，每次30分钟。MABT 的性质比PBS 更温和，更适用于核酸检测。
配制 5x MABT 母液
58 g 马来酸
43.5 g NaCl
55 g Tween-20
900 mL 水
添加三羟甲基氨基甲烷，将 pH 调节至 7.5。大约需要 100 g 三羟甲基氨基甲烷。定容至 1 L。
12) 烘干载片。
13) 将其转移至增湿盒中，向每个切片加入 200 µL 封闭缓冲液（MABT + 2% BSA，牛奶或血清）。在室温下封闭 1–2 小时。
14) 去除封闭缓冲液。将抗标记抗体以所需稀释度加入封闭缓冲液。查看抗体说明书中推荐的浓度/稀释度。在室温下孵育 1–2 小时。
15) 在室温下使用 MABT 洗涤载片 5 次，每次 10 分钟。
16) 在室温下使用预染色缓冲液（100 mM Tris pH9.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）洗涤载片 2 次，每次 10 分钟。
17) 如需进行荧光检测，请跳至第 18 步。对于其他形式的检测，请将载片放回增湿盒中，然后依照厂家说明书(如有说明书的话)使其显色。
18) 使用蒸馏水清洗载片。
19) 将载片风干 30 分钟。然后使用 100% 乙醇进行洗涤，并将其彻底风干。
20) 使用 DePeX 封片溶液进行封片。

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