默克生命科学 | 荧光原位杂交（FISH）

千姿百态

试剂和设备

• 20X 柠檬酸钠缓冲液（SSC：3 M NaCl，0.3 M柠檬酸钠，pH 7或产品货号S6639）更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn
  
• RNase A（产品货号R4642）100 µg/ml于2x SSC中
  
• 胃蛋白酶（产品货号P6887） 40单位/ml于10 mM HCl中
  
• 多聚甲醛，EM级（产品货号P6148）新近解聚的，4% w/v于水中
  
• 乙醇
  
• 标记的探针。通过缺口平移随机引物或聚合酶链反应（如ADVANCE™缺口平移试剂盒）而对质粒DNA进行生物素-11-dUTP标记
  
• 杂交混合液：50％甲酰胺（产品货号F7508）、10％硫酸葡聚糖（产品货号D8906）、0.1％ SDS（产品货号L4390）、0.5-1.5 ng/µl标记的探针和300 ng/ml鲑鱼精子DNA（产品货号D7656）于2x SSC中
  
• 洗涤缓冲液：20％甲酰胺（产品货号F7508）于0.1x SSC中
  
• 检测缓冲液：0.2% Tween 20（产品货号P1379）于4x SSC中
  
• 封闭缓冲液：5% 牛白蛋白（产品货号A3803）于检测缓冲液中
  
• 抗体或检测化合物（如链霉亲和素-Cy3，产品货号S6402）于封闭缓冲液中
  
• DAPI（产品货号D9542）2 µg/ml于抗荧光淬灭封片剂中。
  
• 荧光显微镜、滤光片和可选的三带通滤波器（x58，Omega Optics）
  
• 玻片（产品货号S8400）
  
• 用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片（从可高压灭菌的垃圾袋切下，如产品货号B4408）
  
• 热模块/ 改进的热循环仪
  
• 用于洗涤步骤的科普林缸（产品货号S6016、S5641或S5891）
  

操作流程

玻片制备

• 从任何细胞类型开始染色体制备。
  
• 在37 °C下用200 µL RNase孵育1小时
  
• 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  
• 在10 mM HCl中漂洗玻片。
  
• 在37 °C下用200 µL胃蛋白酶孵育10分钟。
  
• 在去离子H2O中漂洗玻片。
  
• 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  
• 在多聚甲醛中固定玻片10分钟。
  
• 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  
• 在梯度乙醇中对玻片进行脱水：70%、80%、95%；每种2分钟。
  
• 风干。
  

杂交

• 每块玻片制备30 µl杂交溶液。加热至70 °C，维持10分钟后置于冰上。
  
• 每块玻片上加入30 µl杂交溶液并盖上塑料盖玻片。
  
• 在热模块上65-70 °C条件下对玻片进行变性5分钟。
  
• 逐渐降温至37 °C。
  
• 在湿度箱37 °C条件下杂交过夜。
  

检测

• 在2x SSC中洗涤玻片以去除盖玻片。
  
• 在洗涤缓冲液中40 °C条件下洗涤玻片5分钟。重复。
  
• 在0.1x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  
• 在2x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  
• 将玻片冷却至室温。
  
• 在检测缓冲液中平衡玻片5分钟。
  
• 在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。
  
• 用50 µl 抗体或检测化合物孵育30-60分钟（如在封闭缓冲液中的5 µg/ml 链霉亲和素-Cy3）。
  
• 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复两次。
  
• 用DAPI溶液复染10分钟。
  
• 简短漂洗后在抗荧光淬灭封片剂中进行封片。
  
• 用荧光显微镜进行分析。
  

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