CRISPR/Cas9技术国内有哪些优秀团队？

营养师

这一新技术国内水平处于那个阶段？如何赶上？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/40392924

大力水手

CRISPR/Cas9是一项可对基因组特定靶基因进行编辑的DNA操控技术，该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成，Cas9蛋白在sgRNA的引导下对靶位点处的DNA双链进行剪切，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端链接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组(Homologous recombination，HR）的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。
目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术在疾病基础研究、靶点验证、药物分子的高通量筛选、以及遗传性疾病的治疗等领域得到了越来越广泛的应用。sgRNA在CRISPR/Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。
sgRNA的设计流程




sgRNA的设计流程

sgRNA的设计原则
1. sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。

2. sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA  模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG  (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

3. sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。

4. 如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

5. 全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。

6. 如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。
sgRNA设计示范
此处以查询人类WNT10B基因为例。在NCBI Gene数据库中输入需要查找的人类WNT10B基因，查找的结果显示多个与WNT10B相关的基因，这些基因包括了不同物种的WNT10B同源基因。因而查找时需要注意该基因在NCBI的登录号与种属描述等。点击查询人类WNT10B基因，显示出该基因的基本信息（图1）。




(图1) NCBI网站查询WNT10B基因信息

找到该基因的mRNA and Protein(s) 相关信息，查询可知WNT10B的mRNA 编号为 NM 003394.4。如果该基因可以通过可变剪接产生多个mRNA亚型的话，在下图中会依次记录（图2）。



（图2）NCBI网站查询WNT10B基因mRNA信息

使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析，如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子，其中粉色区域为信号肽所在序列，该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除，sgRNA设计时应避免此段序列，最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译，也应该避免采用此段序列，所以最佳的sgRNA靶向序列应采用图中蓝色选定区域（图3）。




（图3）WNT10B基因结构组成图示

选取上图中序列作为sgRNA的靶序列，在sgRNA设计网站输入靶基因信息和设计相关信息。
现在有多种sgRNA设计网站可供选用，常用的设计网站包括：
1. CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）
2. GPP Web Portal （https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public/）
3. E-CRISP （http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）
4. CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/）
此处我们选择张锋实验的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）来进行sgRNA的设计，输入上文选择的靶序列，选定基因对应的物种信息和想要使用的Cas9和PAM种类后点击提交（图4）。




（图4）sgRNA设计

网站生成的sgRNA序列和相关信息如下图所示，信息包括sgRNA的位置，网站给出的特异性评分，切割效率评分，潜在的脱靶结果和脱靶位点相关信息（图5）。



（图5）网站生成的sgRNA方案和分析

sgRNA脱靶分析
网站会生成多个备选sgRNA结果，我们需要根据信息筛选出最佳的sgRNA，上图中根据生成的sgRNA信息，我们可以从特异性评分，剪切效率评分，潜在脱靶情况和脱靶位点信息几个方面进行分析，选取最佳sgRNA。上图中第一个和第五第六个sgRNA被标注为 inefficient，所以我们可以优先考虑第二第三和第四个sgRNA作为备选方案。
除了该网站自带的脱靶信息分析以外，根据选择的sgRNA，我们也可以通过脱靶分析网站对sgRNA进行脱靶分析。
推荐使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在线网页进行预测。将sgRNA序列输入，选定相应种属基因组进行分析。并且对获得的遗传材料进行检测。挑选前10个潜在脱靶位点，通过PCR测序验证是否脱靶。如果实验要求较为严格的，则需要通过全基因组测序鉴定脱靶情况（图6）。



（图6）脱靶分析网站

crispr-cas9基因编辑技术-基因编辑公司-crispr基因编辑技术-细胞基因敲除输入sgRNA+NGG序列和对应信息后，点击提交，得到如下结果图



图7 脱靶分析结果

根据图中信息即可分析sgRNA的剪切效率，潜在脱靶位点信息等（图 7）。
   除上文提到的脱靶效应分析网站外，之前提到的E-CRISP和CHOPCHOP这两个sgRNA设计网站也包含脱靶分析功能。
   sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。sgRNA包括20nt的靶向序列，crRNA，linker loop 和 tracrRNA几个部分共同组成（图1）。通常我们所说的sgRNA设计指的就是针对20nt的靶向序列进行设计，而选择合适的靶向序列就是sgRNA设计的核心工作。
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同花顺

试问2016生物科技是谁独领风骚？
CRISPR/Cas9基因编辑技术当仁不让。
CRISPR/Cas9技术在2016年大放光芒，产业化加速，其专利之争也成为科技界关注的焦点。在中国，有无数研究者使用CRISPR技术加快了科学发展的步伐。以下是中国的CRISPR大牛，不知道其中是否有你熟悉的那一位呢？
一
首当其冲的是四川大学华西医院卢铀教授，他使CRISPR技术的应用领先国外。姓名： 卢铀
职业信息：华西医院肿瘤中心胸部肿瘤科主任
牛13之处：全球首个CRISPR人体实验，将受试者体中的免疫T细胞分离出来，利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑，选择性地敲除细胞基因中编码PD-1蛋白的基因，对编辑过的T细胞培养扩增后，再输回患者体内，该细胞具备了攻击肿瘤细胞的能力，可能将为晚期癌症患者的治疗带来希望。



二
姓名：黄志伟
职业信息：哈尔滨工业大学生命科学与技术学院教授、博士研究生导师；
牛13之处：获得了Cpf1/CRISPR RNA复合物的晶体结构；


网址：http://homepage.hit.edu.cn/pages/huangzhiwei
三
姓名：陈婷
职业信息：北京生命科学研究所即NIBS教授，博士生导师；
牛13之处：首次利用CRISPR/Cas9系统在病人特异性的隐性营养不良性大疱性表皮松解症（RDEB）小鼠模型表皮干细胞中实现成体基因修复；



网址：http://www.nibs.ac.cn/yjsjyimgshow.php?cid=5&sid=6&id=755
四
姓名：魏文胜
职业信息：北京大学教授；
牛13之处：CRISPR/Cas9系统的慢病毒聚焦型人源细胞文库、功能性基因筛选平台以及基于高通量深度测序技术解析数据的完整技术路线；


网址：http://www.bio.pku.edu.cn/teacher_dis_oa.php?cid=208&teaid=78
五
姓名：佟向军
职业信息：北京大学副教授
牛13之处：斑马鱼中的CRISPR/Cas9基因编辑，全国中学生生物竞赛委员会委员；



网址：http://www.bio.pku.edu.cn/teacher_dis_oa.php?cid=146&teaid=70
六
姓名：欧光朔
职业信息：清华大学教授；
牛13之处：线虫的CRISPR基因编辑；



网址：http://life.tsinghua.edu.cn/faculty/faculty/2625.html
七
姓名：高冠军
职业信息：清华大学生命科学学院教授，博导；
牛13之处：发现基因组中存在大量暗物质的功能性证据，领导CRISPR / Cas9介导果蝇的有效条件诱变研究；



网址：http://life.tsinghua.edu.cn/faculty/faculty/1596.html
八
姓名：谢震
职业信息：清华大学信息科学与技术国家实验室，特别研究员
牛13之处：首次发文报道控制Cas9活性的新策略



网址：http://bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/CSSB/web/people/xiezhen.html
九
姓名：高绍荣
职业信息：同济大学生命科学与技术学院特聘教授；
牛13之处：在2009年报道了iPS小鼠的研究成果，从而在世界上首次证明了iPS细胞的真正多能性，被美国TIMES评为2009年世界十大医学突破之一；2015年证实了CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以高效生成基因敲除雪貂；



网址：http://life.tongji.edu.cn/Show.aspx?info_id=1730&info_lb=344&flag=287
十
姓名：宋保亮
职业：武汉大学生命科学学院教授，院长
牛13之处：通过CRISPR/Cas9基因组编辑成功校正了小鼠的PRKAG2突变；



网址：http://www.bio.whu.edu.cn/index.php/View/1973
十一
姓名：朱焕章
职业：复旦大学生命科学学院教授；
牛13之处：利用CAS9技术靶向干预HIV潜伏；



网址：http://life.fudan.edu.cn/Data/View/1464
十二
姓名：袁晶
职业：厦门大学生命科学学院教授；牛13之处：利用CRISPR/Cas9系统，高效实现了疟原虫基因组中的多个基因的不同类型修饰；



网址：http://life.xmu.edu.cn/20/50/c3730a73808/page.htm

十三
姓名：李劲松
职业信息：中科院上海生物化学与细胞生物学研究所；
牛13之处：用CRISPR技术治愈小鼠白内障；



网址：http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=65

十四
姓名：王皓毅
职业信息：中国科学院动物研究所研究员；
牛13之处：率先利用CRISPR-Cas9系统建立了一步获得多基因敲除细胞和小鼠的方法，及一步获得原位基因敲入和条件性敲除小鼠的方法；首次利用电转的方法，将CRISPR-Cas9系统导入小鼠受精卵，并产生有特定基因突变的小鼠模型等；



网址：http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wanghaoyi/

十五
姓名：高彩霞
职业信息：中国科学院遗传与发育研究所研究员；
牛13之处：利用CRISPR-Cas9等技术，在六倍体面包小麦中成功实现同时编辑3个同源等位基因，由此赋予小麦对“白粉菌”的遗传性抵抗力；



网址：http://sourcedb.genetics.cas.cn/zw/zjrck/201001/t20100112_2725447.html

十六姓名：丁秋蓉
职业信息：中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所研究员；
牛13之处：发现降低CRISPR脱靶率的新方法；



网址：http://www.nutrition.ac.cn/PI_dingqr.asp

十七
姓名：高璞
职业信息：中国科学院生物物理研究所研究员；
牛13之处：揭示了CRISPR-Cpf1识别目标DNA的独特机制



网址：http://www.ibp.cas.cn/ktzz/ktzz_AG/201603/t20160330_4577232.html

十八
姓名：王艳丽
职业信息：中国科学院生物物理所研究员；牛13之处：解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构；



网址：http://www.ibp.cas.cn/ktzz/ktzz_W/201308/t20130829_3920466.html

十九
姓名：朱健康
职业信息：中科院上海植物逆境生物学研究中心主任；
牛13之处：CRISPR/Cas9系统可实现对水稻特定基因的高效、可稳定遗传的及特异性的定点突变。这项研究成果为CRISPR/Cas9系统在水稻中的稳定应用及进一步应用该技术提高水稻的产量、抗性及品质等提供了理论基础；



网址：http://sourcedb.sibs.cas.cn/zw/rck/201206/t20120615_3598633.html
希望对你有所帮助。
参考资料：
1 http://mt.sohu.com/20160724/n460751546.shtml2 http://www.nature.com/news/crispr-gene-editing-tested-in-a-person-for-the-first-time-1.20988

欢迎补充。

继续前进

你bing搜下那个crispr-P数据库服务器放在哪里，中国的科研团队牛人还是有很多。

清风寡欲

前几天火石发布了一份基因编辑研究报告，其实关于CRISPR的文章，在论文数量上，中国已经仅次于美国，跟进还是很快的，不断有些新的创新出现，而且最近韩春雨的系统也有很大的创新性，中国在这方面的创新还是值得期待的。
这份报告内容非常详细，有近100页，讲了详细的CRISPR技术路线、应用方向、公司列表、相关政策及产业进展，如果感兴趣，可以在火石搜索，也可以关注下面这个公众号索取：
http://weixin.qq.com/r/Ojn27lfEugrFrRON92wo (二维码自动识别)