手把手教你做CRISPR实验（下）——基因敲入篇

莺歌燕舞

装备清单

1、gRNA载体+Cas9载体（最好弄个一体化的gRNA-Cas9载体）
2、分子克隆实验平台
3、细胞间+流式分选仪
4、一台能浏览网站的电脑
5、能看得懂一些英语的稳定廉价劳动力（研究生）
6、采购ssDNA的钱（或者是制作ssDNA的精力）
教程概述

基因敲入分为两种：
一种是用能够发挥逆转录功能的慢病毒，piggyBac等工具，将基因随机整合到宿主细胞基因组中。
另一种则是在特定位点基因敲入。实现定点基因敲入的方法也有很多，其中最简单的方法就是先用Cas9对这个位置进行切割，然后使用同源定向修复（Homology Directed Repair, HDR），将外源基因给整合进去。除了这种方式，还有很多花里胡哨的方法可以将基因精准地整合进去，例如recombinase mediated cassette exchange（RMCE）等方法。
不过，目前最为广泛使用的还是HDR基因敲入。本文也将一步一步教你如何进行基因敲入。
设计用于敲入的gRNA

设计gRNA的具体步骤在基因敲除篇中已经详细介绍过了，本篇文章仅讲解如何寻找合适的敲入位点
1、确定敲入位点

（1）如果你要敲入的基因不参与翻译（enhancer之类的元件），那么你只要管在你想插入的附近设计gRNA即可，并且根据敲除位点附近的序列设计donor载体（关于donor载体的设计在后文会详细介绍）。
（2）如果你要敲入的基因参与翻译，并只是想让该蛋白表达蛋白，那么将外源基因插入到基因组中的safe harbor位点则是一个很好的选择。几乎所有的物种相应的针对其safe harbor的研究，人基因组的safe harbor有AAVS1，CCR5，以及ROSA26等。中国仓鼠的safe harbor有site A， T2，以及T9。并且，在addgene上，你可以找到相应的all-in-one敲除载体，以及配套的donor载体。顺便提一句，将基因插到safe harbor处的话，需要一同准备自己的promoter，enhancer等元件。



关于safe harbor的具体gRNA设计问题——safe harbor的敲除质粒不必自己设计，如果手上没有现成的敲除质粒，可以选择在addgene上直接购买，或者根据网站上面的图谱，直接仿制一个。同时



甚至，你都不用自己设计同源臂，直接将你想要的插入片段替换掉别人donor质粒里面的插入片段（记得突变掉gRNA的识别位点）

（3）如果你要敲入的基因参与翻译，并需要与宿主蛋白形成融合蛋白，那么你可能需要额外考虑外源蛋白与宿主蛋白之间linker的问题，是使用刚性linker（rigid linker）还是柔性linker（rigid linker），还是选择自剪切多肽（2A Peptide），抑或是不使用linker。
下面附上几个我常用的linker的序列（由于密码子兼并，所以答案不唯一，具体序列需要根据实际情况）
柔性linker：
(GGGS)3 = GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT
刚性linker：
(EAAAK)3= GAA GCT GCG GCA AAA GAA GCA GCG GCT AAA GAA GCG GCG GCA AAA
2A Peptide：
T2A= GAG GGC AGA GGA AGT CTG CTA ACA TGC GGT GAC GTC GAG GAG AAT CCT GGC CCA
P2A= GCT ACT AAC TTC AGC CTG CTG AAG CAG GCT GGA GAC GTG GAG GAG AAC CCT GGA CCT
2、设计gRNA质粒

接下来，我将以制作融合蛋白为例，进行示范
实验目的：将P2A-EGFP插到宿主基因Clec7a终止子TAA前面，通过EGFP快速观察Clec7a的表达
（1）如果我这次做的是动物的基因编辑，我会毫不犹豫地选择iSpyMacCas9（该Cas9的PAM识别序列是TAA ）


虽然这条gRNA序列得分非常低，但是动物通过不断地与野生型交配，能够不断地净化掉那些脱靶敲除的基因（大约8代之后，那些脱靶敲除的基因就没了）
（2）细胞的基因编辑需要比动物的更加讲究一点，最好挑选得分更高的gRNA
如图，我设计了两条gRNA，将包含终止子TAA的一段序列全部敲除。




设计donor质粒，用于同源定向修复

简单科普：
什么叫同源定向修复（HDR）？
通过引入一段外源DNA模板，该外源DNA模板包含想要引入的一段序列，同时它还包含与切割部位两端互补的基因序列（左同源臂HA-L和右同源臂HA-R）。左右同源臂能够与宿主基因互补，因此能够牢牢地抓在基因组上，然后宿主细胞能够以这个外源DNA模板作为参照，修复自身断裂的DNA双链。
此外，HA-L和HA-R的长度对HDR的效率有着重要的影响。根据经验，每个同源臂在500-1000bp范围内，HDR的效率最高。另外值得注意的是，HA-L和HA-R上的gRNA识别位点需要进行点突变。（后文会有详细介绍）
1、设计并制作两个同源臂（homologous arm）

St.1 摘取gRNA1左侧1000bp左右的序列，制作左同源臂（HA-L）
St.2 摘取gRNA2右侧1000bp左右的序列，制作右同源臂（HA-R）
St.3 随后利用NCBI上的primer-blast设计引物。要保证最后的PCR产物要覆盖HA-L和HA-R（也就是说大概得2000-2500bp的样子）由于从基因组中P出目的片段有些许困难，因此可以多设计几条。


St.4 接下来，你将以该PCR产物为模板，设计引物，最终P出HA-L+Exon6部分和HA-R+Intron部分两端片段。（从基因组中成功获得到这片基因的PCR产物之后，后面的PCR就会变得非常简单。原则上保证引物特异性，合适的退火温度和GC值即可。）
2、通过各种手段，获得P2A-EGFP的序列

只要找一个带有这个元件的质粒，利用PCR将其扩增出来即可。
3、构建donor质粒1.0

这时，你拥有了两个同源臂（HA-L和HA-R）的PCR产物，以及P2A-EGFP的PCR产物。为构建出donor质粒，你还需要一个线性化载体（不含启动子，无法表达基因的最最基础的质粒载体）


同源重组的步骤介绍比较复杂，你可以找市面上的各个卖同源重组试剂盒的公司。购买试剂盒的同时，要求他们顺手给你一个这样的线性化载体。大多数公司（vazyme、yeason、tiangen）都有这玩意。
4、构建donor质粒2.0

试想，All-in-one的2个gRNA质粒，以及含有2个gRNA识别位点的donor质粒1.0一同转染到细胞中会发生什么？gRNA质粒切割宿主基因组的时候，会顺便把donor质粒也一并切割了。因此，我们有必要给donor质粒升级改造一下。改造的策略便是将PAM序列或是gRNA结合序列给突变掉。由于密码子的兼并性原理，只要保证最后合成的氨基酸是一样的即可。
该教程也不包含点突变的详细教程，只需要买点突变试剂盒，然后根据里面的说明书操作即可。本教程只演示制定点突变位点的方案。
St.1 第一个gRNA的PAM位点:TGG


由于Trp色氨酸只有一个密码子，所以无法进行同义替换。 因此，只能替换gRNA区域。替换gRNA时候，可以多突变几个位点，降低被gRNA识别的风险。
St.2  第二个gRNA的PAM位点:AGG




根据密码子表格，我们可以将AGG突变为AGA。
制作ssDNA（可选）

由于本教程演示的方案是在一个蛋白表达丰度并不是特别低的蛋白后面插入EGFP。因此，EGFP表达的细胞大概率是敲入成功的，只需要通过流式进行分选出表达绿色荧光的细胞即可。这种基因敲入实验对插入效率的要求并不高。（根据流式分选结果提示，大约插入效率是1/50000左右）但是，对于一些不表达荧光的基因敲入来说，敲入效率尤为重要，因为5万个细胞里面才有一个成功的也太耗费钱和劳动力了。因此除了本类敲入荧光蛋白实验外，都有必要做ssDNA。
ssDNA的制作需要之前构建成功的donor质粒2.0，以及一个ssDNA制备试剂盒。
单克隆筛选

待两个gRNA质粒和ssDNA转入之后36小时，即可开始进行单克隆分选。该介绍做的荧光蛋白敲入可以直接根据绿色荧光信号进行分选。而其他的基因敲入需要根据gRNA质粒里面的荧光进行筛选，然后通过PCR等手段检测基因是否敲入。
<hr/>以上便是基因敲入（HDR）实验的全部技术分享。其中的一些环节（如同源重组、点突变、ssDNA制备）没有详细讲解。因为这些实验都可以通过购买试剂盒，然后与公司技术沟通求教完成。

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