韩春雨没放弃，三年后默默发表了一篇新论文，发明基于CRISPR的RNA追踪成像系统

乔帮主

近日，韩春雨在预印本网站BioRxiv发表了一篇关于基因编辑的新文章：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE.
该研究开发了一种新型的活细胞RNA追踪成像工具——VN-dCasE-VC，效果和可用性更强。
该文章署名单位为河北科技大学基因编辑研究中心，通讯作者为韩春雨，第一作者为高峰。







前情回顾


2016年5月2日，韩春雨（河北科技大学）作为通讯作者在国际顶级学术期刊 Nature Biotechnology 杂志发表了题为：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（使用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑）的研究论文。
该研究称NgAgo对真核生物（包括人）具有基因编辑能力。该研究成功很快在世界范围内爆火，韩春雨老师此前籍籍无名，几乎一夜之间成为学术界网红，被赞誉为“在三流学校取得世界一流原创成果，打破国际基因编辑技术垄断”。
该论文通讯作者为韩春雨，第一作者为高峰，浙江大学教授沈啸为共同通讯作者，但在后续修改版本中，沈啸从作者名单中去除了。



2016年8月，河北科技大学成立基因编辑研究中心，计划投入资金逾2亿元。但NgAgo的研究成果引发广泛质疑，2017年8月3日，韩春雨撤回该论文。2018年8月31日，河北科技大学取消了韩春雨所获得的荣誉称号，终止了韩春雨团队承担的科研项目并收回了科研经费，收回了韩春雨团队所获校科研绩效奖励。
2019年4月4日，预印本网站BioRxiv刊登了一篇来自美国普渡大学研究人员的研究论文，表明NgAgo通过核酸内切酶活性介导增强大肠杆菌的同源重组。BioWorld第一时间解读并报道了该论文，该研究表明NgAgo可以编辑原核生物，但不能编辑真核生物基因组。详情点击：NgAgo可在原核生物上基因编辑

韩春雨最新论文的解读
CasE是Ⅰ-E型 CRISPR复合物的核心成分，它通过结合特定的茎环区域单独处理pre-crRNA，称之为 CasE Binding S，简称为CBS。CasE保守His20参与催化活性，ΔHis26-TtCse3突变的CasE（dCasE）则失去了催化活性，但仍然与其靶标紧密结合。

在该研究中，通过将 split 荧光与dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，构建了活体RNA跟踪工具VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶RNA时才发出荧光，从而增强信噪比。
在活细胞中进行可视化的RNA追踪，不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T细胞中的高水平表达和均匀分布表明CasE和dCasE适合于活细胞中的RNA操作。



为了测试CasE在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性，作者构建了“关闭”报告基因质粒CBS-GFP-N1。它由5'-UTR中的GFP mRNA和CasE结合位点（CBS）组成。当CasE被引入系统时，GFP表达水平急剧下降。
为了进一步测试CasE活性，作者还构建了“开启”报告基因质粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED单体基因的3'-UTR区和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信号，在其3'-UTR中具有lin28信号的RED单体mRNA几乎不能翻译成蛋白质。
CBS-CasE依赖限制性切断lin28信号并从核释放靶mRNA用于翻译（图1E和图1F）。这些表明CasE可以结合并切割哺乳动物细胞中的CBS。






为了将dCasE-CBS相互作用设计到RNA追踪系统中，作者通过将split-FP5-7与dCasE蛋白结合。发现一个版本，即VN-dCasE-VC很难发出荧光，这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态，但是当与靶RNA（CBS）结合时，可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号，即使VN-dCasE-VC表达质粒的转染剂量非常低。



这个示意图画的，真是一言难尽...
接下来作者使用VN-dCasE-VC系统追踪哺乳动物细胞中过表达的β-肌动蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信号，荧光追踪更清晰，因此，可以通过增加CBS的数量来检测低丰度的mRNA。



总的来说，韩春雨团队发明了一种新的RNA追踪工具，将其命名为VN-dCasE-VC。该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定RNA，通过荧光将其可视化。
目前已有两种活细胞RNA追踪成像工具，一种是MS2，一种是Cas13a，韩春雨团队开发的dCasE系统，成像效果优于MS2，而且，dCasE蛋白的分子量为22kDa，远小于Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易递送至细胞内，因此更适合用于活细胞的RNA追踪。
需要特别说明的是，该研究目前发表于预印本网站，尚未经过同行评议，BioWorld如实解读该文章，更多信息可点击左下方阅读原文，获取该论文。



通讯作者：韩春雨



第一作者：高峰


论文链接：

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/05/13/635912.full.pdf
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