流式细胞仪实验的分享和交流——流式检测篇（一）

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在上篇文章中小编已经为大家简单介绍了流式细胞仪以及应用，本篇内容为大家介绍一下流式细胞仪的常规检测实验，为大家更好的使用这个技术以及更好的进行科研工作做出建议和分享。
一、细胞周期检测
1.实验原理
     细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。
     流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理：由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期,S 期和G2/M 期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率（如图所示）。




2.检测样本要求等
（1）检测范围：已固定或未固定的单细胞悬液、新鲜组织
（2）样本形式：预冷的70%酒精固定的单细胞悬液或者新鲜组织
（3）样本量：每个样本不少于106个细胞
（4）检测时限：预冷的70%酒精固定的单细胞悬液一周内均可检测，未固定的新鲜细胞或组织2h内检测。
（5）前处理：细胞固定：每106个细胞加入500ul预冷的70%酒精，4℃2h。
3.实验步骤：
（1）用PBS洗涤细胞一次（离心2000rpm，5min）收集并调整细胞浓度为1×106/ml；
（2）制备的单细胞悬液用体积分数为70％乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；
（3）将RNase A 与PI 1:9混匀，每个样本加入250ul，室温避光30min；
（4）上机检测，记录激发波长488nm 处红色荧光。4. 结果示例：
4.实验结果示例




二、细胞凋亡
1.实验原理
      正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS），通常仅分布于质膜的内叶，因此仅暴露于细胞质中。然而，在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部小叶上。Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS，但是Annexin V就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡细胞排除在外。




2.检测样本要求等
（1）检测范围：单细胞悬液或新鲜样本
（2）样本形式：新鲜制备的单细胞悬液
（3）样本量：每个样本不少于106个细胞
（4）检测时限：2h内检测
3.实验步骤
（1）将冻存管内细胞转移至流式管内，用PBS洗涤两次。
（2）用1×binding buffer重悬细胞，至细胞浓度为2×105/ml。
（3）加入5ul Annexin V-APC染料和5ul PI染料。
（4）4℃避光孵育15min。
（5）上机进行流式检测。
4.实验结果示例：










三、细胞因子检测
1.实验原理
     不同的细胞可合成不同的细胞因子，首先使用刺激剂使细胞分泌细胞因子，同时加入Golgistop阻断细胞因子外排，使细胞因子在胞内聚集，再采用合适的固定剂、透膜剂，从而检测刺激细胞内部的细胞因子、转录因子。
2.检测样本要求等
（1）检测范围：人、小鼠、大鼠新鲜EDTA抗凝全血；人、小鼠、大鼠新鲜组织及新鲜组织制备成的单细胞悬液
（2）样本形式：人、小鼠、大鼠新鲜EDTA抗凝全血；人、小鼠、大鼠新鲜组织、新鲜组织制备成的单细胞悬液需悬浮在含10%FBS的1640培养基内且要保持4℃环境。
（3）样本量：人、小鼠、大鼠新鲜EDTA抗凝全血1ml左右；人、小鼠、大鼠新鲜组织、新鲜组织制备成的单细胞悬液需保证细胞数在5×106以上。
（4）检测时限：24h内检测
（5）运输及储存方式：新鲜EDTA抗凝全血常温即可；新鲜组织、新鲜组织制备成的单细胞悬液需4℃运输；
3.实验步骤
（1）取组织用眼科剪剪碎，300目滤网过滤，收集悬浮细胞。
（2）250 g离心10min，弃上清。用完全培养基（客户提供）重悬细胞。将细胞分成两份。
（3）取一管命名（unstimulate），500g离心5min，弃上清。加入2ml细胞固定液，室温固定20min。500g离心5min，弃上清。
（4）加入5ml 1x细胞破膜液，室温孵育10min， 500g离心5min，弃上清。
（5）加入5ml 1x细胞破膜液，500g离心5min，弃上清。
（6）加入抗体，每支1ul，涡旋混匀，室温避光孵育30min。
（7）领取一管不加抗体的样本作为unstain对照。
4.实验结果示例




      今天小编对流式细胞检测应用就先介绍到这里，后续小编将继续为您带来流式细胞仪应用其他实验介绍，为大家的基础科研实验提供更多帮助！

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