实时荧光定量PCR技术基本原理详解

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01导读
PCR是1984年开始出现的一项基因检测技术，由于PCR技术具有简便易行、敏感度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究和临床检测，成为分子生物学必要的研究工具。传统的PCR定量是应用终点PCR来对样品中的模板量进行定量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于反应体系和反应条件等因素会影响PCR反应效率,甚至出现一些非特异性扩增产物。因此，用终点PCR法来定量并不准确。
实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新的定量技术，该技术克服了PCR法进入平台期后定量的较大误差问题,实现DNA/RNA的精确定量，而且具有敏感度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面都有着重要的意义。


02基本原理
在PCR反应过程中，每经过一个循环,PCR产物量增加.相应的荧光信号强度也跟着增加,此时收集一个荧光强度信号。经过若干个循环后，可以得到一条以循环数(cycle threshold,CT)为横坐标和荧光强度(△Rn)变化为纵坐标的“S"形荧光扩增曲线。




我们将这条荧光扩增曲线人为地分为背景期、指数扩增期和平台期三个阶段:
①背景期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所覆盖，我们无法判断荧光强度的变化。
②指数扩增期，荧光信号呈指数增长，扩增产物的量与起始模板量存在线性关系，在此阶段可定量分析。
③平台期，由于底物耗尽等因素.荧光信号不再呈指数增加。
重要的概念：实时荧光定量PCR技术中有几个重要的概念，包括扩增曲线、基线、荧光阈值和域值循环数。





（1）扩增曲线（amplification curve）: 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
（2）基线（baseline）：是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。
（3）荧光阈值（threshold）:是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。
（4）阈值循环数:表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。

03反应体系
反应体系和条件
（1）模板浓度与纯度:模板的初始浓度越低，结果的重复性越差。初始浓度越高，超出了反应体系的线性范围，则需要对模板进行稀释，否则随着底物的过早耗尽，可能出现假阴性结果。如果待测模板的浓度处于PCR反应体系的最低检出限附近.则需要检测双份以保证结果的可靠性
（2）酶及其浓度:Taq DNA聚合酶有两种，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶：另一种是从大肠埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应需要2.5U的酶。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）Mg2+的浓度: Mg2+对PCR扩增的特异性和产物有显著影响。Mg2+的浓度过高，会增加引物二聚体的形成；Mg2+的浓度过低，会降低TaqDNA聚合酶的活性。

以下表格为20ul反应体系：



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