免疫荧光IF，细胞一定要固定和通透吗？

John

如果不固定和通透是不是无法进行实验？然后，固定剂和通透剂怎么选？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/664243432

大力水手

看你检测的蛋白在胞内还是胞外，胞外可以不通透

大力水手

在免疫荧光实验中，细胞是否需要固定和通透，取决于实验的具体目的和所检测的抗原类型。对于细胞内抗原的检测，固定和通透步骤是必需的；而对于细胞表面抗原的检测，则可能不需要通透步骤。因此，在实验设计时，应根据实验目的和抗原特性来选择合适的实验步骤和条件。

长长的路

细胞的固定和通透是我们在各种细胞免疫荧光protocol上常见的操作步骤。这两个步骤是否是必须的呢？小P就来仔细说道说道。
首先上结论：为了确保免疫荧光实验的准确性和可靠性，‌细胞的固定和通透处理是必不可少的步骤。

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）将抗体与一些示踪物质（荧光蛋白/染料）结合，利用抗原抗体反应对组织或细胞内的靶抗原进行定位和检测。
在这个过程中，‌细胞的固定和通透处理，可以保证细胞完整性/防止结构改变，并允许荧光标记的抗体进入细胞。当然，根据靶蛋白在细胞不同的定位，通透处理方式也不相同（下文详细介绍）。如果细胞不进行固定和通透处理，‌抗原可能会因为细胞的自然状态而移动，‌导致无法准确检测到特定的抗原位置，‌从而影响实验结果的准确性。‌此外，‌固定和通透步骤也有助于减少背景。‌
下面小P详细介绍下细胞固定和通透的操作要点。
1. 细胞固定

1.1 作用

细胞固定主要是为了保持细胞形态的完整性，防止在实验过程中细胞结构的改变。‌
组织或细胞经过固定后可使胞内蛋白凝固，减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；保持组织或细胞的抗原性，避免抗原发生弥散；保持组织和细胞的固有形态和结构。
1.2 固定剂的选择

常用的固定剂种类很多，一般固定剂可分为两大类：可溶性溶剂和交联剂。可溶性溶剂比如丙酮、乙醇等能去除脂类物质并使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂比如多聚甲醛可以通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。
不同类型固定剂优缺点如下：


根据Proteintech多年抗体开发和蛋白检测经验，小P总结了一份【不同细胞器首选固定剂方法】，供大家参考：


当然，固定剂的选择其实是没有通用规则的，以上表格也是经验之谈，不排除有特殊情况。如果没有达到预期的实验效果，您也可以尝试更换其他固定试剂。
1.3 细胞固定的操作

根据靶蛋白定位、样本特性和实验需求，可选择一种合适的固定方法进行操作：
① 室温下，在100%甲醇中孵育5分钟。
② 室温下，在4%多聚甲醛（溶于PBS）中孵育10分钟。
随后用冰PBS洗涤细胞 3 次。
2 细胞通透

2.1 作用

交联固定剂比有机溶剂能更完整的保持细胞结构，保存脂类物质，但也会因此而阻碍抗体-抗原的结合，甚至屏蔽抗原表位，造成阴性检测结果。因此可能需要增加一个通透步骤以使抗体能够顺利进入并接触抗原。


2.2 通透剂的选择

我们可以根据靶标所处的位置进行选择使用或者不使用通透剂，以及选择何种强度的通透剂。
1）如果检测的是胞外表位（细胞膜表面蛋白、膜整合蛋白的胞外段等），则无需进行通透，固定之后即可检测。
2）如果检测的是胞内表位（膜整合蛋白的胞内段、细胞骨架蛋白、细胞器膜外蛋白等），需选择温和的细胞通透剂，比如Digitonin、Leucoperm、Saponin和Tween 20等，它能够在膜上打孔，增加细胞膜的通透性，使抗体进入胞质中，识别胞质中的表位。
3）如果检测的是有膜细胞器内的表位（核内蛋白、线粒体内的蛋白等），则需要采用强通透剂，比如Triton X-100和NP-40等，它们可以部分溶解细胞核膜等细胞器膜结构，使抗体进入细胞器内部识别抗原并结合抗原表位。
2.3 通透的操作

如果靶蛋白为胞内表位，或定位于含膜细胞器内，对细胞的通透处理尤为重要。
①  用PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin）孵育10分钟。
PS：Triton X-100是提高抗体渗透性最常用的去垢剂。但它会破坏细胞膜，因此不适用于定位细胞膜的靶蛋白。
② 确定每种目标蛋白的Triton X-100最佳比例。
③ 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
注意事项

▶一般操作为先固定细胞再进行通透。但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号。
▶选择醛类固定液时，保持其新鲜度，最好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。
▶用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。
常见问题

小P还根据多年实验经验，整理了一份【免疫荧光疑难解析】，针对各种不理想情况分析了“锅”的归属，希望对大家有所帮助！


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