ImageJ实用技巧——平均荧光强度检测(定量分析篇)

空白派

免疫荧光染色是研究特异蛋白抗原在细胞内分布的一种常用实验技术，通过荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位。
但免疫荧光的照片不仅仅可以做形态学分析，还能通过检测平均荧光强度，对特异性蛋白表达进行半定量分析。

在进行平均荧光强度检测之前，首先要清楚平均荧光强度的定义。
对于一张单通道（单色）的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：
平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)
Mean: Mean gray value
IntDen: Integrated Density

公众号的文章对荧光强度测量有更准确的介绍：

下面是一张激光共聚焦显微镜拍的荧光照片，通过这个实例介绍一下，怎么利用ImageJ进行平均荧光强度的检测。
<hr/>以下图为例：


1、加开图像后，提取出单一通道（Image-Color-Split Channels）
如果图像储存时为RGB格式，需要先分割出该通道：


如果图像是8bit, 16-bit, 32-bit，这个图像就已经是单通道的图像了，可以直接进行Threshold操作。
而且32-bit, 16-bit能包含的pixel value的范围更大，编码了更多的信息，如果转成8bit，就损失了信息。

2、调整阈值，选择适当的区域（Image-Adjust-Threshold）


软件会自动选取一个默认值，统一选取默认值（为了消除不同照片，因为手动选取阈值造成的误差，最好使用默认的阈值）。
注意：设定Threshold的本质是尽可能多地选中信号，不选中背景。



红色范围即为选中范围，比例尺未选中呈白色

注意：

• 如果图片上有比例尺，必须调节Threshold，或者框选比例尺的区域Edit-Fill，从而去掉比例尺，否则会影响结果。
  
• 务必用Red来表征选中区域。
  
• 荧光图片的背景通常是黑的，所以需要勾选Dark Background！！
  
• 不用点击Apply、Set等按键，红色部分其实已经选中了。
  

另外，不同Threshold算法会带来不同的结果，如果默认算法（Default）设定的阈值不符合要求，需要重新选择算法。

如果所有Threshold的算法，都不能很好地选中信号的区域，建议尝试其他分割方法，或者手动把有信号的地方圈出来。例如测细胞膜上的荧光强度：

3、选择合适阈值算法（Image-Adjust-Auto Threshold）



Auto Threshold界面

这里选择Try all，点击OK后会列出所有算法设定的阈值：



所有算法的阈值结果

根据结果判断，这里选择Default算法即可。
4、设定需要测量的参数（Analyze-Set Measurements）



Set Measurements界面

确认勾选Mean gray value和Limit to threshold（十分重要），点击OK。如果没有勾选Limit to threshold，则测量的是整张图片的平均荧光强度。


6、检测（Analyze-Measure）
点击Measure后弹出检测结果：



测量结果

Mean即为平均荧光强度。（Mean即Mean gray value，等于IntDen/Area），IntDen=Integrated Density（荧光强度总和）
可以将结果复制到Excel或者直接导出生成csv文件（Results窗口-File-Save as）


这样我们就得出了图片的平均荧光强度，但需要注意的是：免疫荧光是半定量分析，平均荧光强度只能半定量地表征特异性蛋白的表达。
主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多，例如拍照时的曝光、焦距等等，而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候，以及处理数据的时候，一定要有一个固定的标准和流程，从而减小误差。
注意：平均荧光强度并不等于免疫组化中的光密度（Optical Density），所以不需要Invert以及Calibration。单位可以用Arbitrary Units（AU）。

<hr/>如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我，或者给我发邮件：zhaoyc9@163.com
更多教程可以关注我的专栏：
希望对大家有帮助~

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