作为科研狗的我一直对免疫荧光有一个疑惑，就是图片二维的，而细胞是三维的，拍图片正确反映蛋白定位？

乔帮主

作为科研狗的我一直对免疫荧光有一个疑惑，就是图片二维的，而细胞是三维的，拍图片正确反映蛋白定位？
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实验技能分享免疫荧光
免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。它的原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。免疫荧光检测方法
直接免疫荧光：携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物。该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。





间接免疫荧光：先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。（实验室最常用的方法）。



间接免疫荧光主要介绍
间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、以及一抗和二抗的孵育和最后的激光共聚焦拍照。

1.  细胞准备
将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适的密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞过于拥挤，形态不佳且边界不清，并且导致染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，从而易发生非特异性染色，因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。

2. 固定
使用4%的PFA室温固定30min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。





3. 通透
固定结束后，用1×PBS洗三遍后，加入0.1%TritonX-100 100μL/片，室温通透10min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。

4. 封闭
通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭。封闭是为了放置内源性非特异性蛋白抗原结合。





5.  一抗孵育
将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100μL/片。室温孵育1h。





6. 二抗孵育
1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100μL/片。室温孵育1h。





7. DAPI染核
二抗孵育结束后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100μL/片，室温染核10min。

8. 封片
封片：染核结束后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。





9.利用激光共聚焦显微镜拍照
注意事项：
一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；
从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；
洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；
选择合适的细胞密度进行试验。

队长是我

你的想法很好也很合理，因此对于免疫荧光图片的共定位分析除了基本常规的二维图片荧光强度分析还有利用共聚焦做层扫绘制成3D图片后再进行共定位分析。
另外需要说明的是，一般证明两个分子存在共定位现象是为了进一步验证二者是否存在互作的关系，而为了证明互作，免疫荧光实验只是其中一种基础的支持实验，还需要进行coip实验进一步验证，单靠免疫荧光实验想解决这个问题是不充分的

检验医师

我都不知道该怎么说，你这个科研搞的，请问你人是三维的，照片能不能定位你五官的位置？

大力水手

如果用荧光共聚焦显微镜观察，激光只激发细胞很薄一层的蛋白发光，拍出来的照片也只是细胞某一薄层的截面，所以是可以认为就是二维的。