microRNA：甲状腺癌诊断的新兴生物标志物

检验之星

明尼苏达州罗切斯特市梅奥医学中心
分子检测用于诊断甲状腺癌还有进步的空间。2013AACC年会上Alicia Algeciras-Schimnich博士发表了题为“microRNA：甲状腺癌诊断的新兴生物标志物”的报告。本文从microRNA入门，microRNA作为疾病生物标志物和microRNA在甲状腺癌中的作用等两个方面展开描述。

一、microRNA介绍

       microRNA（miRNA）是一类内源性的非编码RNA序列（包含18-24个核苷酸），调节基因表达从而控制细胞过程，包括细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡。miRNA的特异性在于只通过24个核苷酸序列的6-7个核苷酸介导，所以单一miRNA可潜在识别上百个靶基因。大量研究表明很多疾病出现miRNA表达改变，包括恶性肿瘤。近期，据报告在体液（主要是血液）中发现的循环miRNAs是很有价值的疾病生物标志物。

       miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II 或 Ⅲ（Pol II或Ⅲ）转录成多茎环结构（primiRNA）。primiRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下分裂成单茎环结构pre-miRNA。RNA–GTP和exportin 5（输出蛋白5）将pre-miRNA输送到细胞质中。



       输送到细胞质的miRNA被进一步处理为成熟miRNA分子（黄色表示）。成熟miRNA结合到RNA诱导沉默复合物（RISC）。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。根据miRNA与mRNA的互补程度，可能发生两种情况。如果miRNA与靶位点完全互补，那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA裂解。与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达。三分之一的人类基因是以这种方式调节的。因此，通过miRNA这个微调机制细胞可以控制标准转录-翻译范例以外的基因表达。



二、microRNA标志物

1、miRNA标志物的优势
       如果miRNA的靶标是mRNA，为什么不用mRNA代替中间的miRNA呢？分析miRNA的优势在于：第一，miRNA比mRNA稳定得多。循环miRNAs可在室温下稳定至少24小时。大家普遍认为miRNA的稳定性是因为miRNA分子比mRNA分子小。还有大量研究表明内源性miRNA免于降解。第二，miRNA存在于很多组织和体液，分子小，易于提取。但是，很难从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中提取良好品质的mRNA。至于体液，miRNA不仅存在于血清、血浆，还存在于尿液、羊水、CSF等。第三，与成千上万mRNA相比，miRNA的数量有限[1852个前体，2578个成熟miRNA（miRBase，2013年7月11日）]。

2、miRNA标志物的劣势
       为了使临床实践成功引入miRNA分析，有些问题尚待解决。miRNA浓度非常低，尤其在检测血清、血浆或其它体液，或者企图检测细针抽吸活检玻片的miRNA时，很难获得可靠定量。这个领域的不成熟性也不容忽视，技术问题包括分析前问题（溶血），miRNA提取，检测方法和标准化。

3、miRNA提取/定量方法的变异性
       我们对miRNA提取，逆转录（RT）和实时定量PCR程序（qPCR）对miRNA定量变化的影响感兴趣。我们从捐赠者获得血样，分离血清，用基于吸附柱的miRNA提取方法一式三份提取血清。对每份提取物进行一式三份逆转录，然后进入实时定量PCR程序。一个miRNA共产生27个反应，3个个体共得出81个qPCR结果。



       3个内源性miRNA（miR-15b、miR-16、miR-24）与加入秀丽隐杆线虫的对照miRNA（celmiR-39）的批内差异如表1总结。每个miRNA的批内差异各不相同，但是大部分差异来源于提取阶段。外源性miRNA表现出最高批内差异。外源性miRNA不免于降解，降解程度和提取效率不同。因此，秀丽隐杆线虫miRNAs可能不适于作为外部对照。



       如图4所示，miR-16、miR-24、miR-122是内源性miRNA，cel-miR-39是对照miRNA。对于miR-16，25 mg/dL血红蛋白的△CT值是2，1200 mg/dL血红蛋白的△CT值增加到7。miR-24的情况与miR-16类似。miR-122和cel-miR-39不受影响。所以，溶血对某些miRNAs水平的影响显著。红细胞中浓度较高的miRNAs受溶血影响更大。



       miRNA在血清和血浆中差异表达。图5是根据CT值与血清和血浆miRNA绘制的。CT值越小，miRNA浓度越高。血浆样品miR-15与miR-24水平显著高于血清。研究发现血浆miRNA水平较高是由于血小板污染所致。在这两种标本类型中外源性miRNA没有表达差异。该实验表明我们在临床实践中实施这些分析物时要注意血清和血浆样品是不可互换的。



       当前用于分析miRNA的方法主要分为3类，深度测序、微阵列检测和qPCR检测。对于试图发现新miRNAs和分析miRNA SNPs的实验，测序是技术选择。但是这项技术成本非常高而且数据复杂性也高。对于临床实验室人员来说，他们最多执行的是实时PCR检测，分析一小部分miRNAs。这样不能发现新miRNAs和SNPs信息，但是能够根据差异表达辨别良性或恶性样品。微阵列检测主要用于初始实验，在不同疾病阶段分析大量miRNAs。



       miRNA在不同种类的癌症中上调或下调。不管癌症类型，总有一个常见miRNA上调和下调。例如，miR-21的生物功能是促进生殖，侵袭和迁移，所以在多种癌症中其调节是伴随恶性转化的。另一方面，miR-145在很多种癌症中因恶性转化而下调，与其作为肿瘤抑制基因的功能相符。



       大量miRNAs不仅是诊断多种癌症的标志物，还有其他作用，包括预后、治疗效果预测等。例如，在预后方面miR-196a-2表达上调预示胰腺癌存活率差，而miR-221和miR-222上调与乳腺癌病人抗他莫昔芬有关。近期Janssen等人在新英格兰医学期刊上发表的一篇文章表明miR-122的反义寡核苷酸使miR-122隔离从而抑制丙肝病毒复制，研究结果非常有价值。



4、miRNA检测
       市场上可购买到有限数量的mi RNA检测，针对细胞学或组织样品，尚无法检测体液循环miRNA。本文介绍两个产品，miRInform Pancreas和Rosetta Lung Cancer Test。

       miRInform Pancreas检测7种miRNAs的表达水平，结果用分数表示，分数范围是0-1。分数小于0.5是良性，分数在0.5-1之间是PDAC。该检测的临床效用是辅助诊断胰腺导管腺瘤（PDAC）。在这种情况下，细胞学诊断结果为不确定或者良性。检测灵敏度是94.3%，特异性是82.8%。

       Rosetta Lung Cancer Test 检测8种miRNA的表达水平，融合于分类器中有助于区别4种主要类型的原发性肺癌：鳞状细胞癌，非鳞状细胞癌，小细胞癌和肺类癌瘤。检测灵敏度是93.7%，特异性是98%。

三、miRNAs在甲状腺癌中的作用

       甲状腺结节的初始诊断是进行细针抽吸活检（FNAB），然后进行细胞学评估。细胞学结果分为良性结节（65-75%），恶性肿瘤（5%），可疑或不确定（15-25%），和非诊断（5%）。

       基于转移程度，不确定结果从细胞学上又分为意义不确定性异型/意义不确定性滤泡性病变（AUS/FLUS），滤泡性瘤，和疑似恶性肿瘤。很大比例AUS/FLUS重复活检，小部分情况根据其它临床表现进行手术。滤泡性瘤和疑似恶性肿瘤需要手术。AUS/FLUS、滤泡性瘤和疑似恶性肿瘤的恶性风险（%）范围分别是5%-15%，15%-30%和50%-75%。梅奥医学中心的一位同事研究了各不确定种类的组织学转归。89% AUS/FLUS的组织学转归是良性腺瘤，69%滤泡性瘤的组织学转归是良性腺瘤，只有11%疑似恶性肿瘤的组织学转归是良性腺瘤。这意味着大量手术是不必要的，因此，需要更好的生物标志物帮助鉴别哪些不确定种类病人不需要手术。




1、乳头状甲状腺癌
       当前的分子标志物似乎不能满足内分泌学的需要。在乳头状甲状腺癌（PTC）- 最常见分化型甲状腺癌类型的背景下，有很多研究比较PTC和正常组织的上调或下调miRNAs。其中大多数研究使用新鲜冷冻组织，通过微阵列检测分析miRNAs表达。即使这些研究分析的很多miRNAs差异显著，仍发现常见数量miRNAs上调。miRNAs 221和222在比较PTC和正常组织的所有研究中都上调，miRNA 146在50%研究中上调。所以，这三种miRANs可能是潜在的PTC生物标志物。



       miRNAs不仅在诊断中发挥作用，对于预后也是。研究表明在侵袭性PTC中发现miR-146b，miR-221和miR-222上调及miR-34b和miR-130b下调。迄今为止只发表了一篇有关甲状腺癌循环miRNAs的文章。Yu S.等人研究了245例对象，包括106例PTC、95例良性结节和44例健康对照。研究发现PTC病人血清中3种miRNAs（Let-7e，miR151-5p和miR-222）上调。但是，这仅限于一个研究，需要更多研究来确定血清中是否可检测到甲状腺癌特有的miRNA信号。如果是这样的话，我们就可以少做些侵袭性手术，用miRNA代替甲状腺球蛋白监控疾病复发。

       然而，分子标志物用于区别滤泡性腺瘤与滤泡性甲状腺癌的效用有限。滤泡性腺瘤是良性病变，而滤泡性甲状腺癌是恶性肿瘤。在这些情况下，3种突变，PAX8/PPARγ易位、RAS突变、CREB3L2/PPARγ易位是滤泡性甲状腺癌的潜在、特有标志物。不幸的是，我们可以看到并不是所有FTC病例为阳性突变。如果只用这种突变分析就会错过一些病例。另一方面，一小部分良性病变也呈阳性易位。

       至于miRNAs在FA与FTC中的表达，有很多共同调节异常，表明miRNA调节异常是滤泡性转化的第一步。当然，并不是所有miRNA调节异常都有助于区分良性病变和恶性病变。




       滤泡性甲状腺癌miRNA相关文章有限，在不同研究中上调miRNA集合差异显著。在表8给出的4篇研究中，只有两篇研究的miRNA信号重叠。某些差异可用这些研究包含的miRNAs数量解释因为其中一些研究分析的miRNAs集合明显较小。也许，另一个原因是没有分析FTC的突变状态，从而对miRNA的解释不同。



       Reddi等人研究了正常甲状腺组织，滤泡性腺瘤和滤泡性甲状腺癌之间的16种miRNAs差异表达。该研究使用新鲜冷冻组织，可以看到与正常组织和滤泡性腺瘤组织相比，滤泡性甲状腺癌组织中miR-122显著上调。但是，进一步分析数据表明miR-122上调与滤泡性甲状腺癌PAX8/PPARγ易位（PPFP）表达相关，如表9所示。



       用实时PCR，福尔马林固定、石蜡包埋组织证实了这些数据。虽然样品数量有限，FTC PPFP阴性样品与良性和FA的miR-122水平相似，但是FTC阳性样品的miR-122水平与之差异甚大。另外，不考虑突变，与FA相比miR-144在FTC细针抽吸活检样品中下调。所以，miR-144也许对鉴别FTC和FA很有价值。




       目前我们正在分析不确定诊断细胞学标本的潜在miRNA信号组合，如表10所示。这些组合包括恶性肿瘤或良性疾病相关的很多miRNAs。例如，miR-197不仅在FTC中上调，在PTC和ATC（甲状腺未分化癌）中也上调。miR-339-3p在FTC（-PPFP）中下调。miR-122和miR-375与PPFP特异性恶性肿瘤有关。3种miRNAs与良性疾病有关，miR-190在FA中上调，而miR-642和miR-144在FTC中下调。我们希望在不久的将来可发表这些组合用于不确定诊断细胞学的有用数据。



四、结论

       miRNA是前景很好的疾病生物标志物，已在分化型甲状腺癌中鉴别出很多候选miRNAs。理想miRNA集合应该能以高诊断准确度区分恶性和良性甲状腺病变，未来研究应该着重于确认辅助诊断不确定细胞学病例的miRNA组合。