从单分子到临床应用：RCA技术如何重塑超敏蛋白检测

2026-3-10 11:44| 编辑: 沙糖桔| 查看: 135| 评论: 0|来源: 小桔灯网｜作者：净姐

摘要: 关注小桔灯网

随着精准医学的发展，超敏蛋白检测技术正成为早期诊断和疾病监测的关键工具。尤其在阿尔茨海默病、肿瘤和感染性疾病等领域，许多标志物在血液等可及体液中的浓度极低，传统方法难以检出 [1,2]。例如，磷酸化tau蛋白（p-tau217）作为阿尔茨海默病的关键血液标志物，其浓度常在皮克每毫升（pg/mL）甚至飞克每毫升（fg/mL）级别，对检测灵敏度提出了极高要求 [3,4]。

近年来，以数字ELISA和单分子阵列技术（Simoa）为代表的数字检测方法，已实现比传统ELISA高出千倍的灵敏度提升 [5,6]。然而，这些技术仍面临仪器复杂、通量受限、难以实现空间定位分析等问题 [7]。在这样的背景下，滚环扩增技术（RCA）因其独特的信号放大与空间定位能力，正成为下一代超敏蛋白检测平台的核心工具。

一

RCA技术：从核酸扩增到蛋白检测的桥梁

RCA是一种等温核酸扩增技术，可在目标分子位置生成由重复序列组成的DNA长链产物。这些产物可通过荧光探针标记，形成局域化的荧光信号点，每个点对应一个原始检测分子 [8,9]。

RCA的核心优势在于：

信号局域化：无需物理分区即可实现单分子分辨；
多重检测能力：通过序列编码可同时检测多个靶标；
兼容性强：可用于蛋白、核酸、甚至单细胞和细胞外囊泡分析 [10,11]。

在蛋白检测中，RCA通常与免疫夹心法结合：捕获抗体固定在磁珠或玻片上，检测抗体则与DNA引物偶联。当目标蛋白存在时，形成免疫复合物，随后引物启动RCA反应，最终通过荧光标记实现单分子成像和计数 [12,13]。

二

RCA赋能单分子蛋白检测：两大代表性平台

①DISCAN平台：突破Poisson分布限制的数字化免疫检测

由我国学者提出的DISCAN技术，将免疫夹心反应与RCA结合，实现了无需微孔阵列的单分子计数[14]。

技术亮点：

每个蛋白分子触发一个独立的RCA反应，在磁珠表面生成局域荧光点；
荧光点数量直接反映蛋白分子数，不受Poisson分布限制；
检测效率大幅提升：仅需 1×1051×105 个磁珠，比Simoa减少三个数量级；
检测灵敏度达0.022 pg/mL（459.5 aM），比传统ELISA高出千倍，比Simoa提升6倍 [15]。

临床应用：

研究团队利用DISCAN检测了阿尔茨海默病患者血浆中的p-tau217水平，结果显示：

AD患者p-tau217浓度显著高于健康对照组；
与商业试剂盒检测结果高度一致，验证了其临床可靠性 [16]。

② MOSAIC平台：流式细胞术赋能的高通量数字ELISA

由美国学者开发的MOSAIC技术，将RCA与流式细胞术结合，实现了高通量、高灵敏度、高多重性的单分子蛋白检测[17]。

技术亮点：

RCA产物在磁珠表面形成高亮度荧光点，单个阳性珠即可被流式细胞仪识别；
检测效率高达50–60%，比Simoa提升10倍以上；
通过减少磁珠数量（从10万降至1–2万），可进一步提升信噪比和灵敏度；
检测下限可达15.9 aM（IL-10），部分指标灵敏度提**12倍 [18]。

多重检测能力：

MOSAIC平台通过荧光编码磁珠，实现了8种细胞因子的同时检测，包括IL-6、IL-1β、IFN-γ、VEGF等，灵敏度均在亚飞摩尔至低飞摩尔级别，是目前数字ELISA中多重能力最强的平台之一 [19]。

临床应用亮点：

在血浆中，IFN-γ检出率达100%，而Simoa仅94%；
在唾液中，IFN-γ检出率从42%提升至65%，IL-12p70从0%提升至12%；
证明了RCA技术在极低丰度标志物检测中的独特优势 [20]。

三

RCA在单细胞和单细胞外囊泡分析中的拓展应用

除了临床样本，RCA技术也在单细胞和单细胞外囊泡分析中展现出巨大潜力。

单细胞分析：

RNA与蛋白共定位：Deng等人利用RCA在单细胞中实现9种mRNA的多重成像 [21]；
mRNA剪接变体分析：Ren等人通过RCA检测CD45 mRNA的三种剪接形式，揭示T细胞活化状态 [22]；
线粒体DNA突变检测：结合CRISPR/Cas9与RCA，可实现单细胞水平线粒体SNV成像 [23]。

单细胞外囊泡分析：

表面蛋白检测：Zhang等人利用适配体-RCA在单EV上实现三种表面蛋白的同时成像 [24]；
内源性RNA与蛋白共检测：Li等人在磁纳米搅拌器上实现CD63与miR-122的共定位分析 [25]；
单分子分辨率定量：Park等人开发了可裂解RCA平台，克服RCA产物空间位阻，实现单EV表面蛋白的绝对定量 [26]。

四

RCA技术的优势总结与未来展望

RCA在超敏蛋白检测中的核心优势：

维度	优势
灵敏度	可达亚飞摩尔级别（aM），比传统ELISA提升千倍以上
空间定位	无需物理分区，适用于单细胞、单EV等高分辨率分析
多重能力	可通过序列编码 + 荧光编码实现高维度检测
通量	结合流式细胞术，可实现每秒数千珠分析
兼容性	适用于蛋白、核酸、外泌体等多种靶标

未来发展方向：

灵敏度再提升：通过优化抗体亲和力、减少非特异性背景信号，进一步降低检测下限 [27]；
多重能力扩展：结合AI辅助荧光解码，实现百重级别检测[28]；
成本与稳定性优化：开发纳米酶替代phi29聚合酶，提升热稳定性并降低成本 [29]；
POCT集成：将RCA平台整合至微流控芯片，推动床旁检测应用[30]。

参考文献：

[1] Cohen L, Walt DR. Highly sensitive and multiplexed protein measurements. Chem Rev. 2019;119(1):293-321.

[2] Rissin DM, et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat Biotechnol. 2010;28(6):595-599.

[3] Barthelemy NR, et al. Blood plasma phosphorylated-tau isoforms track CNS change in Alzheimer's disease. J Exp Med. 2020;217(11):e20200861.

[4] Teunissen CE, et al. Plasma p-tau immunoassays in clinical research for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2025;21(1):e14397.

[5] Wilson DH, et al. The Simoa HD-1 analyzer: a novel fully automated digital immunoassay analyzer. J Lab Autom. 2016;21(4):533-547.

[6] Cohen L, et al. Single molecule protein detection with attomolar sensitivity using droplet digital ELISA. ACS Nano. 2020;14(8):9491-9501.

[7] Basu AS. Digital assays part I: partitioning statistics and digital PCR. SLAS Technol. 2017;22(4):369-386.

[8] Ali MM, et al. Rolling circle amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine. Chem Soc Rev. 2014;43(10):3324-3341.

[9] Schweitzer B, et al. Immunoassays with rolling circle DNA amplification. Proc Natl Acad Sci USA.2000;97(18):10113-10119.

[10] Xu L, et al. Recent advances in rolling circle amplification-based biosensing strategies. Anal Chim Acta. 2021;1148:238187.

[11] Park J. Rolling circle amplification as a molecular tool for spatially resolved signal amplification in single molecule counting assay. Biosensors. 2025;15(9):628.

[12] Wu C, et al. Ultrasensitive detection of attomolar protein concentrations by dropcast single molecule assays. J Am Chem Soc. 2020;142(28):12314-12323.

[13] Park J, et al. Beads- and oil-free single molecule assay with immuno-rolling circle amplification for SARS-CoV-2 detection. Biosens Bioelectron. 2023;232:115316.

[14] Zhang Y, et al. Ultrasensitive low-abundance protein detection via rolling circle amplification-enhanced digital single-molecule counting. Sens Actuators B Chem. 2026;457:139727.

[15] Dong R, et al. Advances in single molecule arrays (SIMOA) for ultrasensitive detection of biomolecules. Talanta. 2024;270:125529.

[16] Thijssen EH, et al. Plasma phosphorylated tau 217 and phosphorylated tau 181 as biomarkers in Alzheimer's disease. Lancet Neurol. 2021;20(9):739-752.

[17] Wu C, Dougan TJ, Walt DR. High-throughput, high-multiplex digital protein detection with attomolar sensitivity. ACS Nano. 2022;16(1):1025-1035.

[18] Kan CW, et al. Digital ELISA with sub-attomolar detection limits based on low numbers of capture beads. Lab Chip. 2020;20(12):2122-2135.

[19] Tobos CI, et al. Customizable multiplex antibody array immunoassays with attomolar sensitivities. Anal Chem. 2020;92(7):5613-5619.

[20] Ahmad R, et al. A rapid triage test for active pulmonary tuberculosis. Sci Transl Med. 2019;11(515):eaaw8287.

[21] Deng R, et al. DNA-sequence-encoded rolling circle amplicon for single-cell RNA imaging. Chem. 2018;4(6):1373-1386.

[22] Ren X, et al. SpliceRCA: in situ single-cell analysis of mRNA splicing variants. ACS Cent Sci. 2018;4(6):680-687.

[23] Zhang K, et al. Direct visualization of single-nucleotide variation in mtDNA using CRISPR/Cas9-mediated proximity ligation assay. J Am Chem Soc. 2018;140(36):11293-11301.

[24] Zhang J, et al. Localized fluorescent imaging of multiple proteins on individual extracellular vesicles using rolling circle amplification. J Extracell Vesicles. 2020;10(2):e12025.

[25] Li Z, et al. Colocalization of protein and microRNA markers reveals unique EV subpopulations for early cancer detection. Sci Adv. 2024;10(22):eadh8689.

[26] Park J, et al. Agarose microgel-based in situ cleavable immuno-rolling circle amplification for multiplexed single-molecule quantitation on single EVs. ACS Nano. 2025;19(18):17884-17899.

[27] Kohabir KAV, et al. Recent advances in CRISPR-based single-nucleotide fidelity diagnostics. Commun Med. 2025;5(1):252.

[28] Huang R, et al. Deep learning-assisted multicolor fluorescent probes for image and spectral dual-modal identification. Sens Actuators B Chem. 2023;394:134348.

[29] Jiang D, et al. Nanozyme: new horizons for responsive biomedical applications. Chem Soc Rev. 2019;48(14):3683-3704.

[30] Park J, et al. Towards practical sample preparation in point-of-care testing: user-friendly microfluidic devices. Lab Chip. 2020;20(7):1191-1203.

探秘微观，引领生命科技前沿！精准偶联，开启分子操作新时代；超敏检测，赋能临床检验新应用！杭州乐为生医科技有限公司，精心打造多款科研利器：

寡核苷酸偶联试剂盒，实现蛋白分子超灵敏检测；也可用于蛋白蛋白偶联
抗体定点修饰叠氮基团试剂盒，实现抗体修饰的精确把控；
氨基修饰微球抗体偶联试剂盒，实现自主、简便DIY微球修饰抗体/蛋白；
寡核苷酸纯化试剂盒，助力高纯度、高回收率短片段寡核苷酸纯化。

选择乐为生医产品，解锁科研新可能。

技术支持联系电话：13738087339

销售咨询联系电话：18611591243

欢迎扫描二维码添加微信或拨打电话咨询。

声明：

1、凡本网注明“来源：小桔灯网”的所有作品，均为本网合法拥有版权或有权使用的作品，转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源：XXX（非小桔灯网）”的作品，均转载自其它媒体，转载目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有，如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

收藏分享邀请

上一篇：从FDA预警看血糖仪“最后一公里”

从单分子到临床应用：RCA技术如何重塑超敏蛋白检测

声明：

最新评论

相关分类

官方推荐 /3

个人中心