粪便DNA提取试剂盒研发难点以及解决方案

一、为什么研究粪便DNA？它包含有什么生物学信息

1.粪便DNA如何揭示肠道微生物组成：

（1）粪便DNA还可以用于分析肠道微生物组多样性：通过宏基因组研究肠道微生物16S rRNA序列的变化，从而揭示相关疾病。可以直接用PCR的方法进行微生物病原学检测。

（2）健康状况、饮食、地理位置以及疾病治疗都可能改变微生物组的多样性。Righi等人于2022年发表的研究通过对COVID-19患者（2020年4月至2020年12月）的粪便样本进行16S rRNA测序，研究了COVID-19和抗生素治疗对肠道微生物组的影响。这项研究发现，COVID-19的严重程度与机会性细菌的增加呈正相关，另一方面，他们发现了大量的铜绿假单胞菌，这是一种与炎症标志物增加有关的常见机会性细菌。

（3）肠道微生物组影响患有膀胱癌的患者对免疫疗法的治疗结果：2021年的研究利用粪便DNA分析肠道微生物，他们发现，对免疫检查点抑制剂治疗有反应的23名患者的肠道微生物多样性较高，而那些对治疗没有反应的患者则较低。

2.粪便DNA异常甲基化与结直肠癌

粪便中循环肿瘤DNA（ctDNA）中的异常甲基化可以为早期结直肠癌筛查提供新的方法。DNA甲基化可以通过改变基因表达来影响肿瘤发生。对于结直肠癌的早期诊断，检测粪便中肿瘤DNA异常甲基化的方法是一种新的、无创的检测方法。2023年一篇文章发现SDC2以及SHOX2候选基因的CpG位点在结直肠癌组织中的甲基化水平显著高于正常组织。检测162份结直肠癌、46份进展期腺癌和120份健康人粪便样本，发现2个基因和结直肠癌模型的灵敏度分别为91.35%、89.5%和93.83%。早期结直肠癌的敏感性分别为93.62%、92.55%和96.81%。进展期腺癌的敏感性分别为63.04%、82.6%和71.74%。特异性分别为93.33%、85.83%和92.5%。

因此，这两个甲基化位点单独或组合检测不同阶段的结直肠癌具有极好的诊断价值。在粪便样本中可能是筛查和早期诊断CRC和进展期腺癌的一种有效的方法。

二、粪便DNA提取的难点

1.杂质去除困难：粪便样本中含有多种可溶性杂质，如胆红素、胆汁盐、腐殖酸、植物源性多糖等。这些杂质难以洗涤和去除，从而导至提取的DNA纯度低。

2. DNA得率低：粪便样本中脱落细胞较少，微生物含量较低，某些样本中还存在细胞壁较厚的革兰氏阳性菌，裂解不充分或洗脱不充分，都可能导至提取的DNA得率低。

3.PCR等抑制因子的影响：粪便样品中含有的多聚糖、植物多糖、胆酸、胆盐、胆色素、消化液、粘液等均为酶学反应的抑制物，均会对Taq酶等的活性产生影响，从而影响到粪便DNA的下游检测。

一、提取过程中针对性的解决方案

1.针对样本中的腐殖酸、植物源性多糖、蛋白质等，

（1）裂解液或者加一步除杂，里面用到以下的一种试剂或者几种：

①　CTAB（ 十六烷基三甲基溴化铵）：是主要的阳离子表面活性剂，可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物，在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

②　PVP30：聚乙烯吡咯烷酮，样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PVP或PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）等能络合多酚和萜类物质，络合物（不溶）能通过离心或氯仿抽提除去，有效防止多酚氧化成醌类，避免溶液变褐色而具有抗氧化能力。

③　氯化钠：维持盐浓度。

④　Triton X-100、NP-40 、Tween 20等：使蛋白质变性、破坏膜结构以及去除与核酸相互作用的蛋白质。

⑤　SDS：一种非常高效的表面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解，在高温（55-65℃）下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸；提高盐（KAc或NaAc）浓度并降低温度（冰浴），使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀。

⑥　异硫氰酸胍：强力的蛋白质变性剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强，能迅速溶解蛋白质，导至细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。同时它能抑制细胞释放出的核酸酶，抑制RNA酶、防止RNA的降解。

⑦　盐酸胍：是一个核酸酶的强抑制剂。尿素和盐酸胍在高浓度(4-8mol/L)水溶液时能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度的变性；同时还可通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性。

⑧　乙酸铵除杂：乙酸铵在溶剂中竞争结合水分子，导至有机大分子周围水分子减少，自身倾向于自己跟自己互作，导至沉淀。这个有机大分子往往是蛋白质，蛋白复合物等。

（2）磁珠法提取时，选择合适粒径与浓度的磁珠，最好选择几个磁珠厂家，选择不同粒径如300nm、500nm、1000nm，带有不同功能团如羟基、羧基等进行测试，比较不同磁珠的吸附效果以及提纯效果。

磁珠对核酸提取的影响

①粒径：不同粒径磁珠比表面积不同，捕获核酸能力不同（一般来说粒径较大的磁珠，磁响应性比较大，捕获小片段核酸的能力大一点。粒径较小的磁珠，磁响应性比较小，捕获大片段核酸能力大一点；与此同时，粒径较大的磁珠，比表面积较小，捕获核酸能力稍差；粒径较小的磁珠，比表面积较大，捕获核酸能力稍强。）。

②官能基团：在磁珠壳层结构中的功能基层所含的官能团不一样，磁珠与核酸特异性结合能力不同。目前常用的修饰官能团有氨基（-NH2）,羧基（-COOH），羟基（-OH）。由于功能基团不一样，所以使用的结合缓冲液也不同，羟基带有负电性，显碱性，在碱性溶液里能够稳定存在，羧基显酸性，在酸性溶液里能够稳定存在。

③磁珠和液体的比例：磁珠和液体的比例有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率，而且过量的磁珠也会吸附更多的杂质。

磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导至磁珠特性千差万别。所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的（有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取；有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系；有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪，有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。），很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况。

①　使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐（NaI、NaClO4、GuHCl、GuSCN等）。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时，离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合，破坏二者表面原有的水化层，促进磁珠表面与核酸分子的吸附（氢键+范德华力）。

②　羧基修饰磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外，还能通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl，促使核酸分子核酸分子聚集成小球状而吸附到磁珠上。一般来说，在离液盐体系，硅羟基修饰磁珠对核酸吸附效果相对较优；在PEG体系，羧基修饰磁珠对DNA和RNA吸附效果相对较好。

1.针对DNA得率低的情况

（1）增加样本量

（2）进行有效的前处理过程，将杂质提前进行清除，如上一步加除杂液。

（3）裂解不充分：尝试更换新的裂解液；增加裂解时间；改变裂解温度。

（4）与磁珠结合不充分：尝试更换新的结合液；更换磁珠；延长结合时间。

（5）洗脱不充分：建议二次洗脱增加产量。

2.提取的DNA无法扩增怎么办？

（1）检测DNA的浓度：DNA浓度太低。

（2）样本中的腐殖酸等抑制物含量高：稀释样本；或者加PCR增强剂。

相关的增强剂可见：PCR扩增不成功？可能存在PCR抑制剂

参考文献：

[1]Yuguang Shen, Dongyang Wang.Novel DNA methylation biomarkers in stool and blood for early detection of colorectal cancer and precancerous lesions[J]. Clinical Epigenetics.2023:15-26.  

[2]谢程捷,戴一扬. 粪便DNA甲基化在结直肠癌筛查中的研究进展[J]. 中外医学研究.2023,21(1):175-180.

[3]Filippo Pederzoli, Locatelli, I., Riba, M., Bandini, M., Raggi, D., Marandino, L., Alchera, E., Patrizia Giannatempo, Paolo Provero, Lazarevic, D., Lucianò, R., Gallina, A., Briganti, A., Montorsi, F., Salonia, A., Necchi, A., & Alfano, M. (2021). Stool microbiota profiling of patients with muscle invasive bladder cancer receiving neoadjuvant pembrolizumab. Journal of Clinical Oncology, 39(15_suppl), 4533–4533.

[4]Righi, E., Lambertenghi, L., Gorska, A., Sciammarella, C., Ivaldi, F., Mirandola, M., Sartor, A., & Tacconelli, E. (2022). Impact of COVID-19 and Antibiotic Treatments on Gut Microbiome: A Role for Enterococcus spp. Biomedicines, 10(11), 2786.