微滴式数字PCR（ddPCR）作为第三代PCR技术，其核心在于通过"分而治之"的策略实现核酸分子的绝对定量。该技术利用微流控系统将20μL的PCR反应体系分割成约20,000个纳升级的油包水微滴，每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经过PCR扩增后，通过检测每个微滴的荧光信号，统计阳性微滴的数量，最后基于泊松分布原理计算原始样本中的目标分子浓度。 其核心计算公式为： 浓度 (copies/μL) = -ln(1 - p) × (N / V) 其中p为阳性微滴比例，N为总微滴数，V为微滴体积。 从这个公式可以清晰地看出，微滴体积V是计算过程中的关键参数之一。作为计算公式中的分母项，微滴体积的准确性直接决定了最终浓度结果的准确性。而在实际应用中，这个参数却非常容易被忽视。本文我将从核心原理、已报道文献、微滴体积选择策略这三个层面重点阐述。 核心原理：微滴体积影响定量的机制 1. 直接影响检测动态范围 根据泊松分布的基本原理λ = C × V（λ为每个微滴的平均分子数，C为样本浓度，V为微滴体积），在样本浓度固定的情况下，微滴体积直接决定了λ的数值。当样本浓度过高时，会出现"微滴饱和"现象，即绝大多数微滴都变为阳性（p→1），此时系统无法进行准确定量。 检测上限的计算公式：C_max ≈ λ_max / V 其中λ_max通常取5-6（此时阳性微滴比例>99%），这个之前在《说说ddPCR仪的原理和局限》中有提过，为保证变异系数在2.5%以内，λ（CPD，copy per drop）的有效范围需要控制在0.17到5.1之间。 以20000个微滴的系统为例： 当V=0.85 nL时，C_max ≈ 6/0.00085 ≈ 7059 copies/μL 当V=0.795 nL时，C_max ≈ 6/0.000795 ≈ 7547 copies/μL 这表明减小微滴体积可以有效提高检测上限，这对于高浓度样本的检测具有重要意义。 2. 体积准确性决定定量准确性 在实际计算中，微滴体积是一个预设的固定值。如果软件预设体积(V_预设)与实际物理体积(V_实际)存在偏差，将导至系统性的定量误差。 偏差关系式：计算浓度 / 真实浓度 ≈ V_实际 / V_预设 这意味着： 当V_预设 < V_实际时，计算结果会高于真实值 当V_预设 > V_实际时，计算结果会低于真实值 实验证据：微滴体积差异的实质性影响 1. 不同微滴生成器产生的体积差异 研究揭示了不同ddPCR系统之间存在显著的微滴体积差异。在一项系统的实验室间比对研究中发现： DG8手动微滴生成器的平均微滴体积为0.718 nL DG32自动微滴生成器的平均微滴体积为0.739 nL
图片数据来源：DOI 10.1007/s00216-017-0625-y 这两个数值都显著低于当时QuantaSoft™1.6.6.0320（Bio-Rad）软件使用的0.85 nL预设值。值得注意的是，两个DG8设备之间的体积无显著差异（p=0.939），但DG8与DG32系统之间存在统计学显著差异（p<0.05）。这表明微滴体积的差异主要来源于生成器类型的不同。 2. 体积差异导至的定量偏差 该研究进一步评估了体积差异对实际定量结果的影响。使用含有99.9% A2704-12转基因大豆的标准参考物质，比较了不同体积设置下的拷贝数测定结果： 当使用实测体积（DG8: 0.715 nL, DG32: 0.739 nL）替代固定的0.85 nL进行计算时： DG8系统的DNA拷贝数存在+15.9% 的偏差 DG32系统的DNA拷贝数存在+13.1% 的偏差
图片数据来源：DOI 10.1007/s00216-017-0625-y 这一偏差虽然符合当时的最低性能参数要求（≤25%），但对于需要高精度定量的应用而言，已是不可忽视的系统误差。研究还发现，使用固定体积时，DG8与DG32系统间的相对再现性标准偏差（RSDR）对于A2704-12为5.65%，而使用实测体积时升至6.05%（具体见DOI 10.1007/s00216-017-0625-y Table-s9）。表明考虑体积差异有助于更真实地反映系统间的变异。
图片数据来源：DOI 10.1007/s00216-017-0625-y 实践指南：微滴体积选择策略 现在，最新的QuantaSoftTM Analysis Pro (AP)软件允许用户根据实际使用的微滴生成卡在0.85 nL和0.795 nL之间进行选择。这体现了厂商对体积准确性问题的重视。选择时应基于以下原则： 选择 0.85 nL： 适用场景：这是目前大多数检测的默认和推荐选项，尤其适用于中低浓度的样本。 优势：经过多年优化，软件算法和试剂体系与此体积匹配度最高，对大多数靶标能提供稳定可靠的信号和精密度。 检测项目：常规基因表达分析、病原体中低载量监测、稀有突变检测（低MAF） 等。对于低浓度样本，更大的理论体积意味着每个微滴平均分子数（λ）更高，阳性微滴数更多，统计精度更优。 选择 0.795 nL： 适用场景：主要用于超高浓度样本的检测，旨在扩展检测上限。 优势：更小的体积直接提高了体系的饱和上限，避免对高浓度样本进行过度稀释，简化了工作流程。 检测项目：某些病毒爆发期的极高病毒载量样本、细胞治疗中高拷贝数的基因标记、微生物学中高浓度的细菌DNA定量等。 注意事项：对于低浓度样本，选择此体积会略微降低阳性微滴数，可能增加统计波动。 核心选择策略总结：
最佳实践建议： 方法验证：在进行关键实验前，建议使用经过认证的标准品对所选体积进行验证，确保其适用于特定的实验体系。 一致性原则：在同一研究项目中的所有检测应使用相同的微滴体积设置，确保结果的可比性。 结果报告：在报告结果时，应明确说明所使用的微滴体积值，便于他人重复和比较。 不确定度评估：对于无法进行体积验证的实验室，应在测量不确定度中充分考虑微滴体积变异性的影响。 结语 微滴体积作为ddPCR绝对定量的关键参数，其准确性直接影响到检测结果的可靠性。研究表明，不同微滴生成系统之间存在显著的体积差异，这种差异会导至明显的定量偏差。研究者应根据具体的检测需求、样本特性和实验室条件，科学选择微滴体积，并在整个研究过程中保持一致性，这样才能确保获得可靠、可重复的定量结果。 |
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