呼吸道感染（RTIs）是全球发病率和死亡率的主要诱因之一。季节性流感、肺炎支原体（MP）、SARS-CoV-2等病原体常同时流行，其临床症状重叠且难以区分，早期精准诊断对指导临床治疗和公共卫生应对至关重要。因此，迫切需要高通量、多病原体检测，通过快速识别大量患者群体中的致病病原体，减轻医院和实验室的压力。目前主流检测技术如RT-qPCR虽具高灵敏度和特异性，但依赖实验室设施。等温核酸扩增技术如环介导等温扩增（LAMP）无需热循环约束且保留高分析灵敏度，但其应用受限于引物设计复杂性及多重检测中交叉引物干扰等问题。微流控技术将样品制备、扩增与检测集成于微型自动化平台，为呼吸道病原体诊断提供了新思路。然而，现有微流控设备仍存在几个局限：（1）通量受限；（2）手动驱动或复杂离心结构；（3）系统集成度低，易导至污染。 近日，杂志Microsystems & Nanoengineering上发表了一篇题为“A fully automated rotary microfluidic platform for high-throughput multiplex detection of respiratory tract pathogens”的文章。作者开发了一种全自动旋转微流控平台（FA-RMP），用于高通量多重呼吸道病原体检测。FA-RMP能够在30分钟内并行处理16个独立的反应，支持同时检测多达4个不同的临床样品。该平台可在30分钟内检测出50拷贝/μL的肺炎支原体DNA，同时支持3种病原体的检测，为临床呼吸道病原体的多重诊断提供了一种很有前景的工具。
图片来源：Microsystems & Nanoengineering 主要内容 FA-RMP整合微流控芯片、光学检测模块及四通道温控系统，整体尺寸为340mm × 255mm × 230mm，重量小于9kg，适用于POCT场景。FA-RMP将温度控制和荧光信号检测集成到全自动工作流程中，能够同时处理多达四个单独的检测通道，从而实现高通量诊断。微流控卡盒采用旋转驱动结构，集成样本裂解、试剂混合与液体分配功能。通过电机驱动转子旋转，控制液体在裂解室、样本加载室与混合室间定向流动，最终将裂解后样本导入预装冻干LAMP试剂的反应室。FA-RMP可在~ 30min内自动完成核酸释放、等温扩增、实时荧光检测等检测过程。
全自动旋转微流控平台（FA-RMP）概述 图片来源：Microsystems & Nanoengineering 作者优化了LAMP反应内引物（FIP/BIP）、外引物（F3/B3）及环状引物浓度，最终确定了内引物20μM（图a）、外引物5μM（图b）、环状引物10μM（图c）。优化Mg2+浓度为4 mM，以平衡扩增效率与非特异性信号抑制（图d）。
LAMP反应体系优化 图片来源：Microsystems & Nanoengineering 利用MP标准培养物，作者研究了FA-RMP的敏感性和特异性。结果显示，FA-RMP对MP-DNA的检测限低至50 copies/μL（图a），在5000–50 copies/μL范围内，阈值时间（Tp）与模板浓度对数呈线性相关（R² = 0.9528），说明FA-RMP具有很好的定量能力（图b）。在8种非目标呼吸道病原体（流感A/B、呼吸道合胞病毒等）检测中均无交叉反应，证明其具有高特异性（图c）。
FA-RMP敏感性、特异性研究 图片来源：Microsystems & Nanoengineering 通过甲型流感、乙型流感和肺炎支原体（MP）的临床样本，作者评估了该系统同时检测多种呼吸道病原体的能力。临床样品经核酸释放试剂预处理后加入微流控卡盒。结果显示，已知的甲型流感、乙型流感和MP样本都在适当的腔室中特异性检测，没有交叉信号（如下图）。这证明了该分析对临床标本的适用性及其在芯片上多重目标的能力。
病原体的多重检测 图片来源：Microsystems & Nanoengineering 作者开发了一种全自动旋转微流控平台（FA-RMP），用于高通量多重呼吸道病原体检测。FA-RMP通过微流控技术、冻干试剂与自动化系统的融合，实现了呼吸道病原体的高通量、快速以及多重检测。FA-RMP具有30分钟内完成4样本并行检测的能力，可达到50 copies/μL的检测限与100%特异性，适用于资源有限环境中多重呼吸道病原体的同步筛查需求。 但尽管FA-RMP在鼻咽拭子检测中表现优异，但对高粘度样本（如痰液）的适用性尚未验证。未来需扩展复杂样本类型测试，并进一步增加临床样本规模及病原体覆盖范围。同时，平台实时荧光采集与模块化腔室结构为未来集成定量分析及数字LAMP提供基础。通过结合多重等温扩增方法与其他病原体引物，可进一步扩展其应用场景。 |
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