| 昨天，茉莉飘香就中检院的tNGS质量评价发表了评论 同一套考卷，自然能分高下 读完这次的tNGS质量评价文章，个人感觉有一些很有意思的点，分享一下个人观点。整个研究尽量本着中立、客观、严谨的态度来做，在病原微生物检测领域，这应该算是参与单位最多、且质量非常高的横向整体评价了。与研究者上一个mNGS的整体质量评价一样，都值得作为行业发展的一个里程碑式的节点。而在整个研究中，透过数据质量、阳性符合率、阴性符合率、重复性、以及不同微生物浓度范围下的产品检测性能，我们可以看到有规律也有乱象，同时为之后的研究可以提供一些思路。2. 透过数据看看各家参与单位的产品表现（吃瓜群众重点关注哈）PS：这篇仅代表个人观点。如果我俩理解不一样，那么你是对的。欢迎留言区探讨。 茉莉飘香的文章里说得很在点，我们来评价tNGS，到底评价的是什么？业内人士都比较清楚，即使是mNGS，不同技术路线的选择在不同样本类型、及不同临床场景下的表现都是不一样的。那么tNGS作为一种靶向方案，一定是要看产品设计及适用场景的。因此来进行整体评价时，不宜选择太宽泛，需要严格限定样本类型、适用症候群及应用场景，不然容易出现鸡同鸭讲的情况。入选的几家单位，靶点数量从30-700个不等，覆盖的微生物大类也差异较大。以C5家为例，其覆盖靶点种类，看上去比较像一个CNS感染的panel，那么对它的评价就应该同时包含完整病原体颗粒和cfDNA两种类型的效能。“研究使用的参考品不能模拟血液或脑脊液中存在的微生物细胞游离DNA（microbe cell free DNA，mcfDNA）， 因此评价结果不能反映tNGS试剂检测mcfDNA的性能。根据检测原理，相比具有完整全长形态的微生物基因组靶标，对于随机产生的且长度仅有80~160 bp 的mcfDNA 靶标类型[44]， 多重扩增法tNGS 试剂的扩增引物的实际扩增效率可能受到较大影响，从而导至检测性能下降。后续应研制相应参考品，并设计合理的实验室和临床评价方案， 对以mcfDNA 为检测靶标的tNGS 试剂进行有效的验证和确认[11]。”先看图a，对于同样的物种，tNGS的检出reads数比mNGS普遍提升了2-3个数量级，即使是在本次普遍检测表现不太好的物种肺炎链球菌上，这个趋势同样存在。但是来看图b，即使排除肺炎链球菌，tNGS也并没有表现出显著优于mNGS的检测效能。我看不到各家单位真实的数据细节，仅能盲目猜测可能存在两个原因：tNGS在最大化降低了宿主背景干扰的同时，带来了较为严重的假阳性干扰，所以可能会存在的情况是，即使检出了真实微生物，但是难以验证真假，生信和报告组不敢或无法报出。2. tNGS需要针对不同症候群进行靶点检测效能的优化tNGS产品本质上来说是一个正向富集的技术，其检测效能依赖于引物/探针的效果。一个好的tNGS产品需要针对不同症候群的不同病原，去进行针对性的靶点检测效能优化，而市面上很多中大型panel在这上面的内功还是不够的。tNGS的优点是敏感性可能更好，在相同宿主背景下（2X10^5 Hela细胞）用更少的数据量（成本更低），对于特定症候群的针对性低载量病原体的检测有一定优势。根据研究者2021年发表文献的数据表明，同样宿主背景的mNGS普遍需要20M reads左右的数据量来做到10^2数量级微生物的检出。而在本次tNGS质量评价中，各家参与单位能做到用更少的数据量来进行更低的LOD的探索，部分表现优异的单位甚至能做到10^1甚至10^0数量级微生物的准确报出。“从测序数据量来看，有7 家单位的测序数据量采用0~1 百万序列数（million reads，M），4 家单位采用1~10M。”并且有一点是研究文章中未提及，但我认为应该说明的，就是之前关于mNGS研究的阳性符合率统计，应该并未包含10^1甚至10^0数量级微生物的结果符合率的。也就是说tNGS和mNGS两个阳性符合率的统计范围有差异。假阳性的问题是tNGS绕不过去的一大难题，湿实验过程中扩增越多，实验室污染和样本间污染问题就越严重。如我在背景噪音环节描述的，如果实验过程中存在普遍的假阳性检出，生信和报告组会非常头疼，甚至某些情况下的真实检出会被误判为假阳性，从而造成漏报。我仅从一个旁观者的角度来分析，如有错误，欢迎打脸指正。先上一张各家在不同微生物浓度范围下阳性符合率的图。看完这张图，我的感受是行业内还是存在一些技术差距的。“对于微生物浓度水平较高的参考品T1、T5、T9和T13， 仅2 家单位的阳性符合率为100%，分别是基于多重扩增技术的C1 和基于探针捕获法的C10。”不同于研究文章中所述的高浓度范围下100%检出单位C1和C10，我个人认为检测性能表现最好的首先是C10，其次是C4。叠个甲：本人与C10过去现在均无任何利益联系，既不存在雇佣关系也不是托。在大部分浓度范围下都能做到100%检出，仅在T7和T8两个浓度下有漏检，个人猜测可能是带状疱疹病毒的漏检。再结合下图的reads数与微生物浓度的关系，可以看得出C10的探针捕获能力是经过相当程度优化的，即使在低浓度微生物场景下，检出能力也很稳定。作为对比，另外两家同样堆叠了单样本远超过1M reads的单位C4和C6，低浓度下检出序列数下降非常快，C6的阳性符合率也基本上是一路跳水。胖鸽乱入：同样是探针捕获，C6和C10咋就这么不一样。这家是栽在了埃可病毒上，但本次研究埃可病毒的起始浓度也才700copies。总体来说埃可病毒的漏检瑕不掩瑜，在各个浓度范围的检出能力上，是最接近C10的。“对于浓度较低的埃可病毒11 型，tNGS 和mNGS 的阳性符合率均较低，可能与埃可病毒11 型样本中浓度较低和各参加单位生物信息学分析流程相关。”采用多重扩增体系的短读长测序平台，是C1、C2、C4、C7、C9和C11，这一类型技术路线的测序数据中，引物二聚体比例必然偏高，并且有效数据量占比必然会略低。结合这些特点，可以看出各家单位的研发和生信在其中要做的工作仍然很多。C2家的数据质量控制相对较好，引物二聚体比例较低且有效数据量比例较高。因此这家很自信地用相对较少的数据量（0.1M reads左右）来报结果，过分自信的结果就是阳性符合率也是一去不返了。建议下次碰到类似PK不要省钱，宁可少吃两个馒头也要多上点数据量。在75%以上数据比例为引物二聚体的情况下，用远高于1M reads的数据量堆出了仅次于C10的性能表现。纳米孔测序平台的结果和数据，证明这个技术路线的临床应用还远远落后于短读长测序平台。首先三家都在肺链上丢分了，无论哪个角度来看，这都是不应该的，没检出就是该挨打。C3的三百多个病原panel看不太出来是针对哪个症候群的，但C5的30病原panel非常像是一个CNS感染的panel：这种情况下的高浓度的肺炎链球菌、李斯特菌和格特隐球菌漏检就要了老命了，不负责任猜想新生隐球菌的检测效能大概率也不好。C8家的数据比较有意思。通过堆叠纳米孔测序平台下最高的数据量（10^5-10^6 reads每样本），实现了相对还可以的阳性符合率，甚至优于几家短读长测序平台。这也印证了我之前说的，纳米孔测序的应用瓶颈之一，就在于数据量/成本/检测效能的博弈。难道是因为读长不够长且准确度不够，导至未分类序列占比过高？个人还是非常期待SBS法的纳米孔测序体系在tNGS里的应用。仅从研究本身来看，tNGS这个应用仍然只是走在了半路上，还远远没有到成熟的地步（mNGS其实也处在差不多的位置）。从业的各家单位仍然需要从产品设计、适用场景、湿实验、干实验等各方面去进行大量优化。并且tNGS和mNGS是两个不同的产品，要解决的问题不同，优化思路和方向也应该有所偏重。借着这个研究，相信仍然坚守在这个行业的从业者们，能更加清楚差距与不足，更能看清楚行业需求和未来进化的方向。
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