文章内容整理自 中日友好医院 国家呼吸医学中心 鲁炳怀 教授的专题讲座 近年来，高通量测序技术应用广泛。实际上早在2014，已有相关应用。特别是针对种类繁多的病原微生物，目前除测序技术外，很难有一种方法能够把这么多病原从患者的样本里面检测出来。即便是常见的呼吸道感染，其病原体也多为病毒，诸如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等，同时还涉及支原体、衣原体、军团菌等非典型病原体，以及肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等细菌。这些病原在临床引起的症状都非常相似，甚至一些影像学表象也很难做明确的区分。 随着多种抗病毒药物逐步应用于临床，明确病原学诊断变得愈发重要。若能早期确定病原体并实施针对性治疗，将对患者的预后产生积极影响。除常见病原体外，还存在诸多罕见病原体，如真菌种类亦繁多，治疗手段各异。尽管抗真菌药物种类有限，但准确判断感染类型对于选择恰当药物至关重要。例如，针对毛霉感染，应避免使用伏立康唑（因其天然耐药），而应选用两性霉素B、噻康唑或艾沙康唑等药物。 由于病原培养困难，显微镜检查灵敏度较低，很多病原无法通过显微镜诊断。我们一直在积极探索不同的检测方法，如血清检测、GM实验、G试验、抗体检测等。此外，国外亦有文献报道，尿液中的某些特殊蛋白可以作为真菌感染的相关确诊指标。近年来，基因组测序技术的广泛应用在很大程度上缓解了这一难题。 测序技术优势与挑战 一些特殊病原微生物在早期往往缺乏显著的症状和鳞状改变，若能在此阶段准确识别病原体并采取及时的药物治疗，就能有效阻止病情恶化至危重状态。 以毛霉菌为例，在过去案例报道中，确诊时往往病情已进展至肺部出现空洞或侵犯血管，导至患者因咯血而面临极高死亡率。传统指南多主张外科手术切除感染部位。近年来受益于测序技术，检测出了许多毛霉类细菌，包括根霉等，使用博沙康唑、艾沙康唑或两性霉素B等药物也可以取得良好的效果，从而降低了手术干预的必要性。当然，这仅限于早期病变，一旦病原体侵犯血管，引起咯血风险，手术治疗仍被视为首选。 此外，宏基因组测序在分枝杆菌的诊断中也发挥了效能。结核分枝杆菌的诊断历来是一大挑战。传统的抗酸染色法只能检出约20%的结核分子杆菌，而其余80%可能是非结核分子杆菌或其他细菌。不同分枝杆菌的临床治疗差别很大，因此明确其种类至关重要。当前缺乏有效手段来精确区分这些病原体。非结核分枝杆菌的治疗比结核分枝杆菌要困难得多，即使严格按照指南治疗，成功率也仅约60%或更低。早期诊断的关键在于，当病原体载量尚处于低位时，及时诊断并采取干预措施，以提高治疗效果。 对于鹦鹉热病原体感染同样不容忽视，通过分子生物学检测可发现，其感染的几率要远远高于肺炎衣原体。因此，在进行PCR检测时，除考虑肺炎衣原体外，还需特别留意鹦鹉热衣原体。一旦感染，症状可能极为严重，尤其在我国作为家禽饲养大国，感染风险较高。 军团菌感染则也是另一个诊断难题。社区获得性肺炎患者在感染非典型病原体后，往往有两种治疗方案：一种是喹诺酮类，覆盖的病原体范围较广；另一种是头孢类联合阿奇霉素等。然而，这类抗生素对大多数非典型病原体并无覆盖作用，这也是军团菌难以诊断和治疗的原因之一。测序技术的引入为解决这一问题提供了新的途径。 测序技术分类与特点 随着宏基因组测序在感染性疾病诊疗中的作用越发明显，在临床逐渐受到肯定，近年来出来一系列共识：《2020年中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》《2021年高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》《2021年宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》以及《2021年中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识》。 此外，宏基因组测序技术对血液病同样产生了重大影响，尤其是对血液病患者化疗后出现的感染，借助宏基因组测序技术早期发现相关序列并启动预防性治疗，为患者提供更多治愈可能。基于这样的认识，团队针对呼吸道感染等问题，撰写了《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》，并以问题的形式来呈现，解答临床工作中的疑问。
图1 mNGS结果临床解读流程 mNGS即宏基因组测序，虽然具有强大的检测能力，但也带来了一些挑战。有些病原体，尽管在临床上可能并不重要，但mNGS仍能将其检测出，为结果解读带来了困难。例如，呼吸道中常见的缓症链球菌、唾液链球菌、口腔链球菌以及表皮葡萄球菌等，在周围环境中也存在非结核分枝杆菌、曲霉、毛霉等病原体，如果对所有检测出的病原体都进行治疗，将带来巨大的负担。因此，mNGS的广泛应用在一定程度上导至了抗生素的滥用和耐药性的增加，其中的关键问题在于临床医生对病原学和感染性疾病的认识是否清晰。 对mNGS的结果解读容易陷入误区——认为检测出的未知数多的就是病原体，实际并非如此。不能直接以reads（测序判断）判定病原载量，一方面病原类别不同，基因组大小差异。真菌的基因组比细菌大，细菌又比病毒大，因此不能简单地将它们放在一起比较；另一方面，细胞壁成分不同，核酸提取差异。在此鲁炳怀教授提示，有些病原体的核酸很难提取，如果核酸没有充分提取出来，得出的结果肯定与真实情况不符。对于不同类型的样本，是否需要进行PCR扩增等预处理步骤，也需要根据具体情况来决定。流程的规范化对于结果的解释至关重要。 鉴于mNGS的缺点，靶向病原检测（tNGS）突破病原检测的局限性、保障耐药/毒力基因准确检出，成为一个可行的替代方案。tNGS通过先扩增目标序列再进行测序，提高了检测效率和准确性，尤其适用于免疫性疾病患者使用激素治疗前的感染筛查。
不同症候群采用针对性的panel检测 在技术应用与临床实践方面，针对不同样本和部位设计的小检测面板以及针对特殊病原体的tNGS检测，均能有效满足临床需求。同时，探针捕获技术虽多用于肿瘤检测，但其原理同样适用于病原体检测。此外，LDT政策的推动也加速了mNGS等技术的临床落地。 尽管tNGS仍面临一定技术门槛，但其低成本、高效率的特点使其具有良好的应用前景，能够满足大多数临床需求。随着技术的不断进步和政策的支持，测序技术在感染性疾病诊疗中的应用将更加广泛和深入。 总结而言，mNGS与tNGS在患者病原体检出率上均显著优于传统病原学检测方法。尽管tNGS在微生物检出率上与mNGS相当，且能同时检测DNA/RNA型病原体，展现出良好的卫生经济学价值，但mNGS以其更广泛的检测谱和简化的实验流程脱颖而出。然而，mNGS对生信分析及结果解读有较高要求。相比之下，tNGS虽然简化了这些分析步骤，却面临文库制备耗时、检测谱待优化及操作易污染的挑战。因此，两种方法各有优劣，需根据具体情况选择应用。在传统手段培养、显微镜观察等仍然是金标准方法的情况下，我们需要充分利用这些技术来验证测序结果的真实性。同时，我们也应该看到mNGS和tNGS等测序技术的优点和局限性，在未来的临床实践中灵活运用它们来更好地服务患者。 |
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