技术｜如何让熔解曲线分析更加准确

研究人员经常使用熔解曲线分析来评估他们的插入染料PCR/qPCR检测是否产生了单一的、特异的产物。扩增的特异性被认为是插入染料检测比基于探针的检测更值得关注的问题，因为插入染料与任何双链DNA产物结合，不具有序列特异性。

在基于探针的检测中，扩增子特异性引物从探针中获得额外的特异性，探针是第三个序列，必须在目标序列的扩增子中结合，以产生荧光信号。

熔解曲线分析经常被用作一种诊断工具，用于评估插入染料qPCR检测的扩增子长度。在此，我们解释熔解曲线是如何产生的，检查正在使用的假设，并描述一些可用于进一步分析熔解曲线结果的额外方法。

图1显示了两个不同扩增子的熔解曲线。来自CFTR外显子17b的扩增子观察到的单峰（图1A）通常被解释为代表一个纯的、单一的扩增子。相反，来自CFTR外显子7的扩增子的熔解曲线（图1B）显示了2个峰，这一结果通常被解释为表明有两个独立的扩增子。

图1 | 来自CFTR基因的qPCR的熔解曲线。

（A）CFTR 外显子17b的扩增子在熔解曲线分析后显示一个峰，而（B）外显子7的扩增子产生两个峰，通常被解释为代表多个扩增子，而在这种情况下，只产生一个扩增子（图2B）。

事实上，图2所示的凝胶电泳的后续分析显示，这两条曲线都产生一个扩增子，验证了一个PCR产物。为了解释这些明显矛盾的结果，我们需要检查熔解曲线是如何产生的。

图2 | qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示为单一扩增子。

在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分析qPCR扩增子，显示CFTR基因的（A）外显子17b和（B）外显子7均为单条。

qPCR中使用的插入染料只有在与双链DNA（dsDNA）结合时才会发出荧光。在有单链DNA（ssDNA）的情况下，或者当染料在溶液中游离时，它们不会发荧光。

通常情况下，用于运行qPCR的热循环仪被设定为在扩增循环完成后产生熔解曲线。在qPCR运行结束时，热循环仪在一个预设的温度（通常高于引物Tm；如65℃）开始，并测量荧光的数量。

然后在仪器继续测量荧光的过程中，样品的温度被逐步提高。随着温度的升高，dsDNA变性成为单链，染料解离，导至荧光下降（图3）。

图3 | CFTR外显子17b扩增子的解离曲线。

测量荧光随温度升高的变化。随着温度的升高，扩增子的2条链分离，形成单链DNA，导至荧光插入染料与DNA解离，停止荧光。

然后将该曲线的斜率变化作为温度的函数绘制出来，得到CFTR 外显子17b的熔解曲线（图1A）。

对这一曲线的解释是基于这样的假设：扩增子处于2种基本状态中的一种，即双链或单链；也就是说，当dsDNA开始熔解时，它迅速解体，没有中间状态。这一点经常被观察到，因此可以得出一个简单的、通用的规则。

然而，如果我们将这一规则应用于CFTR外显子7的熔解曲线（图1B），两个峰值将被解释为两个不同扩增子的熔解事件。但我们知道CFTR外显子7的扩增子是一个单一的DNA产物（图2B）。那么，我们如何将这两个相互矛盾的想法统一起来呢？

需要重新评估DNA熔解是基于2个状态的事件（dsDNA和ssDNA）的假设。如果我们允许DNA有可能承担一种既不是dsDNA也不是ssDNA的中间状态，并重新审视CFTR外显子7熔解实验的原始数据（图4），就有可能以另一种方式解释数据。

图4. | CFTR外显子7的解离曲线。

随着温度从65℃升高，测量荧光的变化。随着温度的升高，扩增子的2条链分离，形成单链DNA，导至荧光插入染料与DNA解离，停止荧光。曲线在80℃和85℃之间的肩部表明存在一种中间状态，即DNA既是双链又是单链结构。

当dsDNA开始熔解时，扩增子中比较稳定的区域（如富含G/C）不会立即熔解。这些稳定的区域保持它们的dsDNA构型，直到温度足够高而导至其熔解。这种情况导至了2个熔解阶段。

图4中的数据与这种解释是一致的，这导至了图1B中的曲线。额外的序列因素也可以导至产品在多个阶段熔解。这些因素包括富含A/T区域的扩增子错位，以及在扩增子区域有二级结构的设计。

4.1   琼脂糖凝胶分析

分析qPCR产物的黄金标准仍然是对反应的一部分进行琼脂糖凝胶显像。单一条带的出现表明是单一产物（图2）。

4.2   uMelt℠

另外，为了减少确认单一扩增子存在所需的凝胶数量，可以使用uMelt熔解曲线预测软件，这是一个可靠、灵活、免费的在线工具，由犹他大学创建。这个程序可以预测qPCR长度的扩增子的熔解曲线及其衍生物，非常适合测试单个扩增子产物中的多个峰。

uMelt可以稳健地预测熔解曲线的形状和解离过程中出现的复杂的熔解转变。递归地使用最近邻热力学，通过一个非常容易获得和使用的界面，计算出不同温度下扩增子的螺旋度。

uMelt采用的算法已经过同行评议[1]，用户可以从各种设计迭代中进行选择，使该程序越来越受欢迎。

尽管大多数qPCR母液是专有的，但犹他大学的科学家们发现，该算法在各种条件下和各种母液中都能得到一致的曲线形状。变化的主要参数是扩增子熔解的温度；曲线的形状和预测峰数的能力保持不变。

图5显示了qPCR熔解曲线、反应产物的溴化乙锭染色凝胶和同一扩增子（CFTR 外显子13）的uMelt预测。uMelt预测的熔解曲线的导数与热循环仪的实际测量结果密切相关。

图5 | CFTR 外显子13的比较分析。

对CFTR外显子13产生的扩增子进行了仪器衍生、琼脂糖凝胶和uMelt分析的比较。

（A）仪器得出的熔解曲线表明存在两个扩增产物。

（B）溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶显示qPCR产物为一条带子。

（C）预测的uMelt解离曲线显示了与不同稳定性区域相关的轻微变化。

（D）从C中的解离曲线得出的熔解曲线显示了uMelt预测与仪器获得的实际熔解曲线（如A所示）的吻合程度。

uMelt的预测能力使其不仅可以用来确定一个扩增子是否具有多相熔解曲线，而且还可以预测扩增子内序列变化引起的曲线的相对变化。这一特点使uMelt在高分辨熔解（HRM）等应用中非常有用。

PCR产物的HRM分析正越来越多地被用来鉴定单核苷酸多态性（SNP）。uMelt程序具有预测单碱基变化引起的熔体特征变化的敏感性。这些预测可与gBlocks®基因片段对照一起使用，以准备样品进行HRM分析。

本文所介绍的数据表明，尽管熔解曲线分析可用于确认qPCR产生了单一扩增子，但双峰的出现并不总是表明非特异性扩增。其他分析工具，如琼脂糖凝胶和uMelt熔解曲线预测软件，可与仪器生成的熔解曲线一起使用，以确定扩增子的纯度。