研发| PCR试剂的脉门，如何设计引物和探针？

引物设计：

引物（primer）：

是DNA复制的起始点提供3′-OH，由一小段单链DNA或RNA构成。

DNA引物设计：

PCR引物在聚合酶链式反应中，需要一对DNA引物，即正向引物（forwardprimer）和反向引物（reverseprimer）。正向引物是与DNA双链中无义链结合的引物，而反向引物是与有义链结合的引物。

引物设计原则：

• 引物与模板互补
• 引物与引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
• 尽量避免引物在模板的非目的位点结合

• DNA探针：即一段DNA片段。早期主要用于Southern印迹杂交，通过克隆基因、限制性内切酶获得特定片段制备DNA探针。也可通过PCR扩增或人工合成获得。
  
  

  

  
  
• RNA探针：指带有标记，能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。由于RNA是单链分子，它与靶序列的杂交反应效率较高。目前RNA探针主要有3种类型：
  ① 单链cDNA探针：它可通过RNA逆转录获得；
  ② cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得；
  ③ 寡核苷酸探针：以核苷酸为原料，通过DNA合成仪人工合成。
  
  
• 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。

  

  
  
• 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。
  

• 探针的设计对杂交检测至关重要，它决定着检测的特异性。探针与目标核酸相互作用越强，探针检测的特异性越高。
  
• 影响检测特异性最重要的因素是探针的长度。目前，根据探针寡核苷酸的长度，可以分为两类：
  
  长探针：其长度在500～5000 bp之间，靶序列上存在点突变或多态性也不影响其杂交检测，因而特异性和敏感性都能得到保障。
  短探针：其长度小于500bp，它对点突变或多态性的检测比较敏感。

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