【微流控】体外诊断微流控技术在检验当中的应用和挑战！

微流控研究起始于20世纪90年代，至今已经有20余年的发展历史，其间经历了基础理论奠定、单元操作技术发展、小规模集成和大规模集成几个历史发展阶段。至今，微流控技术发展臻于成熟，已经在多个领域得到认可并被广为利用，其产业化趋势亦是愈发明显。2003年《福布斯》杂志把这项技术评为“影响人类未来15件最重要发明之一”；2004年，美国Business2.0杂志封面文章将微流控芯片列为“改变世界”的７种技术之一；2006年Nature杂志出版了一期微流控专辑，题名为“本世纪的技术”。微流控（microfluidics）的含义是微尺度下的流体控制，其研究对象是使用微米级通道操控纳升级以下微量液体的系统。

鉴于芯片是实现微流体控制的主要平台，因而微流控芯片（microfluidicchip）是微流控的主要研究内容。微流控芯片的制作主要依托于微机电系统（MEMS）加工工艺，具有在微米尺度级别实现微量流体操控的能力。

微流控芯片技术的特点来自于两个方面：

一是微流体的特性：微尺度下流体的一系列特殊效应包括层流效应、表面张力及毛细效应、快速热传导效应和扩散效应等，这些效应有利于精确流体控制和实现快速反应；

二是微加工工艺带来的结构复杂性：微加工工艺具有加工小尺寸、高密度微结构的能力，便于实现各种操作单元的灵活组合与规模集成。因此，样品前处理、分离与分析、检测等实验流程得以在同一芯片上集成化和并行化，从而达到微型化、自动化、低消耗和高效率的目的。微流控芯片作为当代极为重要的新型科学技术平台，非常符合国家层面产业转型规划。目前，微流控芯片研究的主流已从平台构建和方法发展转为不同领域的广泛应用，并从应用需求中寻求科学问题，进而带动产业化发展。

一、微流控体外诊断技术

体外诊断是指对人体的体液和组织等进行检测而获得临床诊断信息。目前，承担体外诊断的单位主要是医院的检验科和第三方检验机构。体外诊断是典型的流体操控过程，追求操作便利性和分析结果准确性，因而微流控芯片是实现体外诊断的有利技术平台，这表现在以下几个方面：

（１）应用场景拓展：传统的检验设备多为大型仪器，虽然在测试通量和稳定性上具有优势，但其使用局限于专业实验室。微流控芯片系统体积小巧、操作简单，完全可以在门急诊、基层医疗单位甚至床边进行检测，这极大地拓展了体外诊断的应用空间；

（２）分析效率的提高：集成化和并行化设计的微流控芯片系统，有能力在短时间内提供更为丰富的诊断信息，因而显著提升了分析效率；

（３）测试成本的下降：微流控芯片使用微小反应体积，有利于减小试剂样品消耗，从而降低测试成本。概括来讲，微流控体外诊断技术的优势可以归结为多、快、好、省四个字，这种分析技术无疑是对现有体外诊断技术的巨大提升。

二、微流控体外诊断技术的应用

当前，传统的体外诊断技术已经极为成熟。微流控体外诊断产品若要进入体外诊断市场，势必要展示出高人一筹的能力。相比较传统的宏观检验设备，微流控产品最大的市场拓展潜力在于：

（１）针对传统产品无法适用的应用环境开发产品；

（２）发展性能指标和操作便利性具有明显优势的颠覆性新产品。一个成功的微流控体外诊断产品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和测试成本等几个方面达到平衡。以下，我们就几个主要的临床检验应用领域介绍一些代表性的微流控诊断技术。

（一）分子诊断

分子诊断是新兴的检验医学领域。随着荧光定量ＰＣＲ的推广，基因检测技术在临床医学中得到了广泛应用。尽管如此，现有核酸分析平台的一些不足之处还是限制了分子诊断技术的推广，诸如：

（１）场地要求严格，试剂准备、核酸提取和扩增需要分别在独立房间内进行，极大限制了该技术在有限医疗资源条件下的开展；

（２）采用离线式分析，操作复杂、分析周期较长，不利于应对突发性事件；（３）现有的荧光定量ＰＣＲ方法多是针对单一指标检测设计，对于多重基因检测无论是操作繁琐程度还是测试成本均是难以接受的。分子诊断是微流控芯片技术最具有代表性的应用领域。对于分子诊断应用，微流控芯片最大的贡献在于该技术有潜力将核酸提取、扩增和检测集成于同一装置，因而可摆脱繁琐操作以及对专业实验室的依赖。此外，由于反应过程处于封闭的环境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片还需要具有一定的分析通量以满足临床实际需求。已经商业化的微流控分子诊断产品基本都是针对病原微生物检测应用，其价值在于：

（１）实现现场快速检测；

（２）解决难于培养鉴定病原（如结核杆菌、病毒、支原体等）鉴定问题。具有代表性的微流控分子诊断产品包括GemeXpert系统是一种整合全自动样品制备的模块化实时定量PCR仪，该系统可自动完成样品裂解、核酸纯化浓缩、定量PCR扩增检测，提供快速、准确的测试结果。同时，该系统采用了模块化设计，可依据通量需求选配1～80个可独立运行的微流控分析模块，且每个模块可以同时检测1～4个指标，因而具有较大的通量和灵活性。与GemeXpert系统类似，ｉｏ系统也可以自动完成样品前处理、扩增检测，从样品加入到结果检出所需的时间仅为30min。略有不同的是，io系统利用不同的电化学标签标记的ＤＮＡ探针可在单张芯片内同时检测最多24个指标，更为轻便且无需光学校准。目前都是全集成多重PCR检测系统，所采用的微流控芯片均集成有细胞裂解、核酸提取纯化、PCR和产物检测功能。二者不同之处在于，前者采用两步法多元巢式PCR扩增并结合熔解曲线进行产物分析，后者利用杂交芯片检测多元PCR扩增产物，二者的单芯片检测指标数高达24，但都不具备定量能力。作者课题组最近发展了一种串联液滴阵列微流控芯片核酸分析系统，其设计理念是平衡集成、通量、成本及便携性等关键因素。系统所用微流控芯片上设计有多组以狭缝通道连通的串联微池，全部分析试剂均以油包水形式预存储于其中。通过磁铁阵列驱动磁珠在串联液滴中穿行，依次完成细胞裂解、核酸的结合、洗涤、洗脱和扩增，从而实现了平行化的全集成核酸分析。该系统极为紧凑，适合于现场快速检测及医院门急诊场景下的“随到随检、快速响应”需求。

（二）免疫检测免疫检测是临床检验极为重要的领域。

目前，临床免疫检测的主流技术是化学发光和免疫比浊法，具有灵敏度高和检测线性范围宽的优势。这些检测方法一般使用大型仪器，分析通量较高。由于购置成本和仪器体积因素，这类设备仅适合于大型实验室使用。用于快速免疫检测的主流技术是基于试纸条的胶体金法，虽然使用方便，但在灵敏度和线性范围方面受限。因此，临床检验工作需要一种兼具操作便利性和定量准确性的免疫检测平台，这对于急诊以及基层医疗单位的免疫检测尤其重要。已经见诸报道的微流控免疫产品多是针对心脏病和急性感染这些迫切需要快检的项目。如华迈兴微的Ｍ２微型化学发光分析仪，使用磁微粒免疫化学发光技术，在芯片上集成了血液过滤、免疫亲和、磁珠洗涤、酶促发光反应和信号检测等步骤，整个分析过程10～15min可完成。仪器使用自动识别密闭芯片卡，可避免交叉污染，减少人为失误。由于操作简便，非专业人员亦可完成。Ｗａｋｏ诊断公司的μＴＡＳＷａｋｏｉ３０免疫分析仪使用等速电泳方法，所用芯片集成了试样加载、混合、样品在线富集和检测等步骤。该仪器可对每份样本进行６种分析物的检测，并在９min内即可获得检测结果。深圳微点公司的ｍＬａｂｓ®荧光免疫检测平台由定量荧光免疫检测仪和配套的一次性微流控检测卡组成。该系统采用毛细管力作为流体驱动力，因而无需外部流体驱动装置，每张芯片进行一个或多个指标检测，检测时间仅需４～８min。作者课题组发展了一种微流控芯片免疫化学发光分析系统，该系统采用具有平行串联微池结构的微流控芯片，结合液滴和磁微粒操作可在芯片上完成免疫化学发光分析的全部流程。借助平行化芯片设计和检测器的快速扫描，可以在同一芯片上实现多个感染标志物联合检测。

（三）病原微生物检测病原微生物检测

主要包括病原鉴定和药物敏感性判定两个方面。目前，临床微生物检测面临的最大问题就是检测周期过长。对于感染性疾病，临床医师做出经验或循证诊疗方案选择的时间窗口通常很窄（甚至＜１０min）。只有尽可能缩短分析测试时间，才能更加有效地发挥这些检测的临床指导作用。然而，目前的病原微生物鉴定和药物敏感性判定的典型周期是２～３ｄ，这显然难以满足临床需求。病原检测技术的限制所带来的结果是，一方面经验性诊断的准确性难以保证，另一方面抗生素滥用引发了严重的耐药问题。微流控技术对于病原微生物鉴定的解决方案多是采用核酸检测策略，这在前面部分已经叙述。鉴于抗生素敏感性测试（ＡＳＴ）的实质是判定病原微生物在药物暴露条件下的增殖情况，对应的微流控分析策略是：

（１）通过微缩培养器体积，实现检测信号的相对富集；

（２）使用更为精准的病原定量技术。这两种策略均可以通过缩短病原培养时间实现快速的药物敏感性判定。目前尚无成型的微流控药物敏感性检测产品，但相关研究仍在不断探索。Ｋａｕｓｈｉｋ等利用微流控液滴技术，将细菌和抗生素混合后分散于含有荧光底物的皮升级体积液滴中，依据荧光显色结果判定细菌存活。得益于微体积液滴对荧光反应产物的相对浓缩效应，该方法仅需１ｈ即可判定大肠杆菌对于抗生素的敏感性。Ｓｃｈｏｅｐｐ等报道了基于液滴数字ＰＣＲ的ＡＳＴ。相比较定量ＰＣＲ，ｄＰＣＲ具有更高的准确性和更宽的检测范围，因而可以更加灵敏地反映出细菌计数的变化。研究结果显示，应用ｄＰＣＲ方法可以在抗生素处理后１５min显示出敏感菌和耐药菌的数量差异。由此可见，应用ｄＰＣＲ可以显著缩短ＡＳＴ分析所需的抗生素暴露时间。基于这些具有借鉴意义的工作，作者课题组发展了一种基于液滴阵列微流控芯片的数字化抗生素敏感性测试方法，其设计理念是借助于数字化分析的精准定量能力缩短细菌抗生素暴露时间。细菌悬液与抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴发生和捕获，生成高密度微液滴阵列。通过对液滴阵列进行荧光扫描成像，检测每个液滴中的荧光信号并以此计算出阳性微液滴比例（ｐ）。根据ｐ值用泊松分布算法推算出细菌密度即可反映抗生素对于细菌的增殖抑制效应。应用该方法，仅需30min抗生素暴露时间即可判定大肠埃希菌的抗生素敏感性测试结果。

三、微流控体外诊断技术的机遇与挑战

目前，我国正处于巨大的社会变革过程当中，一方面国力的增强和科技的进步促进了新技术的发展和推广，另一方面新形势对于体外诊断行业提出了新的要求。体外诊断作为一个高附加值行业，将会在未来相当长的阶段中快速发展。随着医疗改革的推进，三级医疗体系将逐渐完善，随之而来的是医疗资源由集中模式转变变为分散模式，第三方检验机构的兴起，以及共享经济模式的冲击，势必会对体外诊断技术提出更高的要求。在这种形势下，微流控技术将会对体外诊断行业的发展提供一个有利的契机。虽然微流控体外诊断技术得到了学术界和产业界的普遍认可，现实中的微流控体外诊断产业进程仍然是步履艰难。相比较研究领域取得的巨大进展，微流控体外诊断技术的产业化进程要缓慢得多。从技术角度来看，微流控体外诊断产品开发涉及多个学科领域，包括医学、生物、化学和工程等。任何一个企业，想要建立这样一个规模的研发队伍都绝非易事。以微流控芯片为载体的微分析体系并非只是对应的宏观体系的简单微缩，其在很多方面都有别于传统产品。例如，微分析体系的表面效应特征非常突出，这是由于其比表面积的显著增加。相应地，各种表面效应变得非常显著，无论是表面张力、表面吸附还是热传导效应都与宏观体系有很大差别。因此，与表面效应相关的各种因素，包括材料性质、通道尺寸、试剂成分、表面处理工艺都会对分析功能造成显著影响。还有，微流控芯片制造涉及的ＭＥＭＳ技术，也并非传统的加工工艺。由于传统体外诊断制造业对于上述问题了解有限，导至了微流控产品的研发难度远远高于传统体外诊断产品。从产业环境角度看，研究、生产和应用单位的脱节，高端加工技术的欠缺也增加了微流控产品开发的难度。从临床应用角度看，现阶段的微流控产品仅在某一些临床应用中的检测性能或效率可以达到甚至超越传统技术方法平台，但尚未形成全面超越的优势，特别是微流控技术存在的一些局限，包括难以快速处理大体积中的低丰度样品、高比表面积带来的样品吸附损失加剧等问题，也给其临床应用造成不利影响。从质量控制体系角度看，作为新入场者的微流控诊断产品尚未建立或健全与之相适应的质量控制体系，在一定程度上也限制了其在包括基层医疗单位及家庭等更广泛场合的推广应用。令人欣慰地是，目前已经有部分微流控诊断产品开始步入了临床应用，其相比于传统平台方法的一些优势已初露端倪。但是，总体上看，微流控技术仍未能如预期那样对传统体外诊断产品带来巨大冲击。对于上述问题，我们认为微流控体外诊断技术产业化过程中以下几个方面值得关注：首先是明确的市场定位，相比较传统技术，微流控产品必须在某个应用领域或应用场景下具有突出的优势；其次是前期研究基础，由于微流控产品研发技术门槛较高，缺少扎实的研究基础会增加开发进程的不确定性；再者就是尽量规避技术制约，由于各种条件限制，某些类型芯片可能在一定阶段内不具备量产可行性。因此，我们对于微流控诊断产品开发的建议是：（１）选择恰当的应用对象；（２）整合研发资源，研发团队需要包含技术、工程和应用专家；（３）创造性的产学研合作模式。

四、结语

总体看来，微流控体外诊断技术的发展前途是光明的，道路是曲折的。无论如何，我们坚信微流控技术是新形势下应对临床检验医学挑战的有力工具，该技术势必会对临床检验能力的提升起到巨大的推动作用。