1 确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书,检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是,需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。 2 确定耗材及配件是否使用正确 耗材对于荧光定量PCR来说比较重要,很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。耗材的检验可以参照老师都没教过的PCR实验室辅料质检,常见的耗材相关问题包括: 1)错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材 普通PCR耗材一般透光度比较差,会造成荧光扩增曲线异常,比如打折的扩增曲线(图三)。 图三:错误使用普通PCR耗材的结果 2)未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材 荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种,如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材,则会造成耗材压扁,甚至造成机器故障;如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材,则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触,从而出现热传导不充分,进而影响酶的活性,会引起重复性不好(图四),或者溶解曲线多峰(非特异扩增),甚至是假阴性结果; 3)使用了质量比较差的耗材 目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多,质量也是良莠不齐,在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的,否则会引起一系列问题,造成不必要的浪费。 比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定,这会造成反应孔的自动基线扣除错误,得到不准确的CT值(图五上图),更换质量好的耗材后,荧光信号正常(图五下图); 图五:质量不好的耗材引起荧光值不稳定图 如果使用的PCR反应板封膜质量不好,在PCR过程中受到水蒸气的影响,容易产生变形(图六),这样会引起“optical warping”,即“光学扭曲”现象(图七 上图),该实验中由于使用了ROX作为参比染料,ROX有效的校正了这种荧光信号的变化,均一化的扩增图结果是正常的(图七 下图)。 图六:PCR过程中水蒸气使得封膜变形 图七:光学扭曲结果图及ROX均一化结果图 除了耗材外,跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确,比如配套的8联管托架,在使用的时候只用托架的下半部分,如果忘记把上半部分取下,有可能会影响扩增(图八)。 图八:未将托架上半部分取下,造成有些靶标未扩增 3 确定所用试剂是否正常 如果设置都正确,耗材及配件也都没问题,但是扩增曲线还是异常,这时候要确定下所用试剂是否正常。 首先要确定试剂是否有效,包括查看试剂是否在有效期内,是否反复冻融多次,运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号,结合实验中的阳性对照结果,确定试剂的有效性。其次要观察扩增完的试剂体积,如果在扩增过程中有试剂的蒸发,可能会引起扩增曲线抬升现象,如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光,ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增,还是蒸发。 比如反应体系存在蒸发,水分丢失,ROX浓度会增加,ROX参比荧光上抬(图九上图),而正常孔中ROX荧光会一直不变(图九下图),所以在加完试剂上机前,一定要检查耗材是否已经密封,防止试剂蒸发,试剂蒸发严重的还可能导至整个实验室的气溶胶污染。 图九:试剂蒸发引起扩增曲线抬升 4 确定实验过程中的操作细节 如果以上都正常,还要确定下实验过程中的操作细节。 比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品,如果不是梯度稀释标准品,可能会引起标准曲线扩增效率或者R2值异常; 从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀,如果试剂融化后没有混匀,这时候取出的试剂不是均一的,会影响后面的扩增; 定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀,如果没有混匀,特别是样本体积比较大的时候(超过PCR体系的20%),更容易发生optical mixing现象。 因为样本是水相会在上层,试剂(含有甘油成分)会在下层,在前期的PCR过程中不足以混匀完全,这样会形成折射,荧光较强,而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀,荧光就变稳定了(图十)。 图十:样本跟预混液未混匀现象 还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡,有气泡的话,中间容易形成折射,干扰荧光的采集(图十一)。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。 图十一:反应体系中有气泡 其他异常曲线,实战分析:
qPCR实验室面临的最大问题就是核酸气溶胶污染的问题,每个实验室都要特别注意。 资料参考:临床检验医学、赛默飞生命科学服务平台、检验视界网等,如涉及侵权联系作者删除。 |