1 确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书,检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是,需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。 2 确定耗材及配件是否使用正确 耗材对于荧光定量PCR来说比较重要,很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。耗材的检验可以参照老师都没教过的PCR实验室辅料质检,常见的耗材相关问题包括: 1)错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材 普通PCR耗材一般透光度比较差,会造成荧光扩增曲线异常,比如打折的扩增曲线(图三)。 图三:错误使用普通PCR耗材的结果 2)未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材 荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种,如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材,则会造成耗材压扁,甚至造成机器故障;如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材,则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触,从而出现热传导不充分,进而影响酶的活性,会引起重复性不好(图四),或者溶解曲线多峰(非特异扩增),甚至是假阴性结果; 3)使用了质量比较差的耗材 目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多,质量也是良莠不齐,在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的,否则会引起一系列问题,造成不必要的浪费。 比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定,这会造成反应孔的自动基线扣除错误,得到不准确的CT值(图五上图),更换质量好的耗材后,荧光信号正常(图五下图); 图五:质量不好的耗材引起荧光值不稳定图 |