二代测序（NGS）实验室建设原则及经验分享

2021-1-2 21:25| 编辑: 小桔灯网| 查看: 4595| 评论: 1|来源: 体外诊断价值圈

摘要: 导读高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。因其高通量、不依赖于已知核酸序列和具有更高的灵敏度，从最初未知β属冠状病毒的快速鉴定 ...

导读

高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。因其高通量、不依赖于已知核酸序列和具有更高的灵敏度，从最初未知β属冠状病毒的快速鉴定到病毒序列的完整破译，再到病毒序列的变异监测，高通量测序技术在疫情防控工作中发挥了非常重要的作用。

欧阳能太

教授

现任中山大学孙逸仙纪念医院病理科副研究员，细胞分子诊断中心副主任

于中山医科大学取得医学本科和病理硕士学位，德国慕尼黑科技大学取得医学博士学位，在纽约医学院和纽约州立大学完成博士后训练

曾分别任广州医学院附一院病理医师、Texas A&M University毒理与肿瘤实验室Scientist和纽约州立大学肿瘤预防研究所副教授

主要研究方向为肿瘤病理曾获多项美国NIH研究基金

发表SCI论文50多篇以及Elsevier和Springer出版社Book Chapter多篇

NGS实验室建设原则及注意事项

欧阳能太教授：NGS技术是精准医学领域中一项非常关键的技术。精准诊断离不开分子诊断，而NGS技术是其中最难亦是应用最广的一项分子诊断技术。NGS技术相对比较复杂，需要一整套的系统工程才能完成，其中NGS实验室的建设非常关键，也容易出现问题。

NGS实验室的建设原则可参考我们这一领域的大咖李金明教授提出的一个原则，其称之为“16字方针”，即各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。前两个原则涉及如何设置，后两个原则则提醒注意不要走过头，应根据医院的实际情况，注意工作的方便，不拘泥于标准。这也是我提醒大家需要特别注意的第一点。目前各个医院对NGS技术的支持力度很大，但在建设NGS实验室时需注意总体面积不宜过大，以免能耗消耗非常大。此外，在实验室各区比例的设置上不要求平均比例，有的环节很小即可，有的环节可相对较大一些，即比例要合适。随着医院对NGS实验室的支持力度越大，要求也越为严格，但有些医院也出现走极端的情况，即分区非常多，房间数很多，但实际并不方便工作。应注意类似步骤的合并，设置适当的房间数。

第二点，需注意风向。其一，NGS实验室应使用全新风系统，而不能使用普通家用空调。新风系统可排出污染，而这是防污染最基础的设置。其二，需注意整个房间的气流方向应形成对流才有效。其三，目前出现问题较大的是生物安全柜、通风柜和超净工作台这三种设备的合理配置使用。对于样本的处理，需使用生物安全柜。生物安全柜通常使用A2级，不要太高级，30%外排即可满足基本需求。B2级过高，100%外排，其实并不是很合适。超净工作台除了在试剂准备间中可以使用外，其他地方不适宜使用。在所有环节中均使用超净工作台是不对的，因为超净工作台没有外排功能，如果DNA气溶胶一直在室内循环是不合适的。而有的单位为了重视起见，所有环节，包括文库构建都使用生物安全柜，实际上也没有必要。除了样本处理间，其他地方使用通风柜即可。相关注意事项很多，在此不一一赘述。

NGS质量控制三大要点

欧阳能太教授：NGS技术是一项系统工程，质量控制非常重要，主要的质控点有三个。第一个便是肿瘤样本的质控。在实际工作中有时会出现搞错样本的情况，或是前期诊断的失误等。例如，对肺腺癌进行EGFR检测，但如果拿到的是小细胞肺癌的样本，则通常不做。其次，对样本中癌细胞的数量要进行质控。细胞数量太少，可能无法测出。虽说NGS灵敏度比较高，但仍有检测下限。而癌细胞占比也很重要，如果癌细胞占比很小，而其他细胞占比很大，也会影响检测灵敏度，此时需要进行富集。概而言之，即在肿瘤样本的质控上需注意肿瘤类型、癌细胞总体数量和占比。

第二个质控点是文库构建。文库构建是一个中间环节，即上机之前样本是否准备妥当。主要涉及浓度和片段大小是否符合要求。浓度，一般使用Qubit测浓度即可；片段大小，通常用Agilent 2100做质控。

第三个质控点是数据，即测序后下机的数据是否符合要求。因为前两个步骤可能没有发现问题，但最后测序却不行。这其中涉及很多方面，包括测序仪本身运行是否正常等。数据质控是最后一个质控点，如果上述均无问题，则可进行后续的临床分析和解读。

NGS应用前景展望

欧阳能太教授：NGS技术非常强大，也是一项非常好的技术，其应用于临床也才刚刚起步，目前还有很多大医院都没有开展。我相信在未来NGS技术的应用不论是使用的范围，还是使用的深度都将有很大的发展。

高通量测序（NGS）实验室

高通量测序（NGS）实验室是什么？

高通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以高通量测序技术为检测手段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项目。

由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导至检测结果不准确；且NGS实验要求高、影响因素多，实验过程处理不当也会导至检测结果异常。因此一个严格有序、规范的NGS实验室是非常必要的。

高通量测序（NGS）实验室

目前高通量测序技术在临床检测上的应用越来越广泛，今天给大家简单介绍一下NGS实验室的建设和合理分区。

一、什么是高通量测序（NGS）技术？

高通量测序技术又称NGS (Next Generation Sequencing) 技术，它是对传统Sanger测序技术（即一代测序技术）进行了革命性的升级，可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，使得转录组学和基因组学被广泛应用于临床疾病诊疗实践中，预示着疾病诊疗分子时代的到来。

二、什么是高通量测序（NGS）实验室？

高通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以高通量测序技术为检测手段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项目。高通量测序实验包括湿桌实验过程和干桌实验过程，其中湿桌实验是指实验标本预处理、核酸提取及其片段化、建库、扩增、靶序列富集、混样、测序前准备及测序，干桌实验是指测序后的数据分析、对比、注释和结果报告等生物信息学分析流程。

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