立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 专家视角 查看内容

【专家论坛】分子诊断技术在细菌耐药性检测中的应用

2020-9-23 00:00| 编辑: 归去来兮| 查看: 3092| 评论: 0|来源: 中华检验医学杂志 | 作者:蒋晓飞 倪语星

摘要: 细菌对抗菌药物的耐药问题严重困扰着抗感染治疗。分子技术能够快速、敏感、准确地检出细菌的耐药机制,提高抗感染治疗的疗效和感染控制的水 ...



文章来源:中华检验医学杂志, 2020,43(07):702-706

作者:蒋晓飞 倪语星




摘要

细菌对抗菌药物的耐药问题严重困扰着抗感染治疗。分子技术能够快速、敏感、准确地检出细菌的耐药机制,提高抗感染治疗的疗效和感染控制的水平。质量保证体系的建设是分子诊断技术在细菌耐药性检测中有效应用的保证。但是,由于细菌耐药机制复杂,再加上基因突变等因素,依靠检测一种或数种耐药基因的分子方法存在假阴性、假阳性,以及机制与表型不一致等问题,对分子检测技术的应用有一定的限制。随着分子技术的发展及人们对细菌耐药机制的认识不断加深,分子诊断技术在细菌耐药性检测中的应用必将更加广泛。




抗菌药物耐药(antimicrobial resistance,AMR)的细菌不断增加,已经给临床抗感染治疗带来极大的困难,成为一个世界性的医学难题。根据2017年中国耐药监测网监测数据,在我国,肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为20.9%和24.0%。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药率分别为35.3%和80.3%。与2005年相比,肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率上升幅度高达8倍[1]。快速、准确地检测病原菌及其耐药性,一方面可帮助医生选用合适的抗菌药物治疗,有利于提高疗效,缩短疗程,延缓耐药菌株的出现;另一方面还可以及时分析和掌握耐药细菌的来源和分布,耐药性变迁的信息,有利于流行病学监测和医院感染控制。传统的抗菌药物敏感性试验依然是目前抗感染治疗的主要依据,但检测周期长,不利于及时进行抗感染治疗和感染控制。分子生物学方法检测速度更快,灵敏度和特异性更高,能够提供准确的有关耐药机制或基因型的信息,可以实现精准的治疗和感染控制,并且可减少不适当的抗菌药物使用以遏制细菌耐药,延长目前可用抗菌药物的寿命。


一、细菌耐药性检测中应用的分子检测技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是细菌耐药性检测中最常用的分子技术,它是20世纪80年代开发的一项技术,它的出现彻底改变了分子生物学[2]。该方法使用正向和反向PCR引物在脱氧核糖核苷酸存在下由DNA聚合酶快速扩增目标DNA,从而达到检测核酸的目的。常规PCR是通过对比耐药菌株与野生菌株靶基因内的差异,从而发现基因内突变,进而判断耐药基因的存在与否[2,3]。实时定量PCR(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)使用荧光探针实时监测目标DNA序列的扩增,不需要使用致癌物质溴化乙锭,因此比常规PCR速度更快,也更安全[2,3]。RT-PCR联合使用高分辨率熔解曲线分析法可以分析扩增子内单核苷酸突变,非常适合检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、卡那霉素/阿米卡星的耐药性。多重PCR可以同时扩增多个目标DNA片段,因此通常用来检测多个不同的基因,在耐甲氧西林金黄色葡萄球的检测和革兰阴性菌β内酰胺酶基因的检测中应用广泛。多重PCR可以使用常规PCR或RT-PCR进行。等温PCR技术的整个过程都在恒定的温度下执行,因此可以使用简单的水浴或加热元件进行扩增,再通过光度法测量浊度,在床旁检验(point-of-care testing,POCT)和资源贫乏的地区非常有用。

DNA芯片是在一个载体上点上数百到数千种已知的特定的DNA探针,通过杂交分析确定测试分离物中是否存在待测基因。在AMR检测方面,以结核分枝杆菌最为详细,例如Vladimir Mikhailovich等用含42个寡核苷酸探针的芯片可以快速检出rpoB基因中的30个突变。

FilmArray采用巢式多重PCR技术,通过分析第2个PCR的扩增产物的裂解曲线获取检测结果。该法将所有步骤(包括核酸提取、纯化、扩增和检测)结合在一起,形成一个封闭的塑料薄膜袋。袋装试剂重新水化并注入临床样品后,再将FilmArray®袋装到FilmArray®仪器中。该仪器无需用户干预即可执行液体处理,温度循环,扩增子检测和高分辨率熔解分析步骤。分析前操作所需的动手时间少于2 min,仪器大约在1 h内产生结果。可同时检测包括病原菌及耐药基因在内的多个目标。

全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)数据是在高度复杂的测序平台,对每个基因组高通量产生大量短reads(称为x倍覆盖),通过恰当的生物信息技术整合而成WGS数据。WGS不仅能够同时覆盖许多不同的靶标还具有检测特定基因亚型变体的能力。但WGS成本高,即使获得了全基因组序列,还需要适当的生物信息学方法才能从WGS数据中获取准确的耐药相关信息。目前WGS检测AMR尚未真正进入临床。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在高真空系统中将样品分子离解成带电的离子,并通过测定生成离子的质荷比(m/z),进行样品成分和结构分析。由于该方法简便、快速,成本低廉,在细菌菌种鉴定中广受欢迎。现在已有采用MALDI-TOF MS检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的报道[4,5]。因为难于找到可靠的AMR蛋白或其水解产物标志性质荷比峰[6],临床微生物检验中的实际应用目前还仅仅限于细菌菌种鉴定。


二、分子技术在常见细菌耐药性检测中的应用现状

分子技术在细菌耐药性检测中的应用大致分为3种情况:(1)特征性耐药基因的检测,例如对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌;(2)从1种细菌中检测可能携带的1种或数种耐药基因,及可能因突变而形成的耐药基因亚型,例如产生超广谱β内酰胺酶和碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌;(3)检测细菌因抗菌药物作用靶位基因突变而导至的耐药,例如多药耐药结核分枝杆菌。下面就以这3种典型的细菌来阐述分子技术在常见细菌耐药性检测中的应用现状。

1.甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA):
金黄色葡萄球菌是当今医学上最重要的病原体之一。MRSA不仅对抗菌药物的疗效降低,而且还导至住院时间延长以及更高的感染发病率和病死率[7,8]。葡萄球菌对甲氧西林的耐药性是由mecA介导,mecA既可出现在金黄色葡萄球菌(特异性标记基因为nun),也可以出现在凝固酶阴性葡萄球菌。

大多数检测MRSA的分子方法基于PCR。"第一代"MRSA PCR检测方法为多重PCR,同时检测mecA、nun及1个凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative Staphylococcus,CoNS)特异性标记基因。本法特异度和敏感度高,可准确判断mecA的来源。但当所有3个PCR信号(mecA、nuc和CoNS标记基因)都阳性时,仍无法确定mecA来源于金黄色葡萄球菌还是凝固酶阴性葡萄球菌[9]。"第二代"MRSA PCR采用RT-PCR扩增mecA-orfX区域的DNA序列(该区域为葡萄球菌染色体基因盒mec分型(Staphylococcal cassette chromosome mec typing,SCCmec)与金黄色葡萄球菌染色体整合的区域,orfX为金黄色葡萄球菌特异的开放阅读框)[9]。本法特异性高,不受CoNS影响。"Xpert MRSA"是一种新开发的MRSA检测方法,该法在封闭的自动化集成平台(GeneXpert DX仪器;Genzyme Virotech)上进行。由于具有自主PCR模块,可以做到POCT,进一步减少从筛查到报告检测结果的时间[9]

2.产生超广谱β内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBL)和碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌:
肠杆菌科细菌感染通常用β内酰胺类抗菌药物治疗,肠杆菌科细菌对β内酰胺类抗菌药物耐药已经严重困扰着临床抗感染治疗。对β内酰胺类耐药最常见的机制是细菌产生了种类繁多的β内酰胺酶,其中最重要的是ESBL(常见的类型是TEM,SHV和CTX-M)和碳青霉烯酶(KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP等)。当前,KPC基因介导的碳青霉烯耐药影响最大[10]

肠杆菌科细菌最重要的是KPC基因的检测。现已开发了一系列的检测KPC基因的常规PCR方法,能够直接从粪便、直肠或其他拭子、阳性血培养物里检出KPC基因,敏感度和特异度好[11]。但常规PCR不能确定携带KPC基因的病原菌种类及其表型。

除常规PCR之外,hyplex®-MBLID多重PCR-ELISA(Amplex Diagnostics,Gars,德国)将IMP和VIM基因的多重PCR扩增产物与固定在ELISA microwell板上的寡核苷酸反向杂交,然后通过过氧化物酶偶联的抗体使杂交复合物显色来检出耐药基因。Check-Direct CPE(CDCPE;Check-Point,瓦格宁根,荷兰)是一种多重RT-PCR,该法使用5种标记有4种不同荧光团的探针来检测碳青霉烯酶KPC、OXA-48、VIM、NDM和内标。Verigene革兰阴性菌血培养检测系统是一种类似DNA芯片的检测系统,可以直接从阳性血培养瓶中检测9个属/种靶细菌和ESBL或碳青霉烯酶基因(CTX-M、KPC、NDM、OXA、VIM和IMP)。Verigene处理器自动执行核酸提取、纯化、芯片杂交和信号放大,然后在Verigene Reader中分析结果,整个过程约2 h。所有这些分子检测方法都显示出极好的灵敏度和特异性[12,13]

FilmArray技术安全快速可同时检测多种基因,在ESBL的检测中也得到广泛应用,例如FilmArray®BCID可检测27种微生物靶标,其中包括24种针对革兰阳性、革兰阴性细菌和真菌的属和种特异性靶标如mecA、vanA/B和blaKPC

3.MDR-TB的检测:
全球结核病负担仍然很重,尤其是多药耐药(multi-drug resistance,MDR)(至少对利福平和异烟肼耐药)和广泛耐药(extensive drug resistant,XDR)(除至少同时对利福平和异烟肼耐药外,还对氟喹诺酮耐药及卡那霉素或阿米卡星或卷曲霉素耐药)结核的发病率仍在不断增加。分子技术能快速、特异地检出结核菌的耐药性基因及突变,在结核菌感染的诊治中作用巨大[14]

对一线抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)的耐药常由于编码药物靶标的基因发生突变而导至,例如对异烟肼耐药是由于编码过氧化氢酶过氧化物酶基因(katG)突变导至,尤其是315密码子(katG315)的突变。对RIF耐药则是由于编码roB中的81 bp大小片段的基因突变所致[15]。因此,在结核菌耐药检测中最常用的分子技术是RT-PCR和DNA芯片。另外,Xpert MTB/RIF可在快速鉴定结核分枝杆菌的同时检测结核菌对RIF的耐药性,在对涂片抗酸染色阳性(有时涂片染色阴性)的临床样本快速鉴定MDR-TB和XDR-TB中使用非常广泛[16]

PCR扩增耐药靶基因,然后对扩增子测序,对检测结核菌的耐药性也很有价值。对MDR-TB和XDR-TB菌株进行全基因组测序能够同时检测多个靶基因耐药性突变[17]。但是全基因组测序成本高昂,目前尚未在临床标本的检测中应用。


三、分子检测技术在细菌耐药性检测中面临的问题

1.质量保证体系:
随着分子技术的广泛应用,临床抗感染决策以及感染控制决策对分子技术的依赖度高,对分子检测结果准确性的要求也达到空前的高度。

目前,国内常用的耐药基因分子诊断技术多为基于扩增的PCR技术,由于PCR是在体外对目的片段进行特异扩增,导至结果有可能出现假阳性或假阴性。因此,为保证PCR检测结果的准确、可靠,实验室必须建立完善的质量管理体系,规范化的培训检测人员,以强化检测人员的质量保证意识,定期校准项目涉及的仪器设备才能保证分子检测结果准确性。

目前,我国分子检测实验实行的是多部门管理:开展分子检测的实验室需经过各省市临检中心的分子生物学实验室验收[18],实验开展后的质量归临检中心管理,实验涉及的试剂和仪器则归药品监督管理局管理。其他国家,比如美国,没有分子生物学实验室验收一说。美国临床实验室改进法案(Clinical Laboratory Improvement Act/Amendment, CLIA)允许通过CLIA认证的临床实验室开展自开发试验(laboratory-developed test, LDT),在CLIA规则下定期检查(美国实验室将开展的LDT项目告知美国病理学协会,在规定周期内的现场评审中美国病理学协会将重点考评LDT项目),确保LDT遵循必要的程序,LDT检测只能在执业医生、实验室科学家、遗传学家和分子病理学家等实验室专家的指导下进行。

2.细菌耐药性分子技术检测相关的质量问题:
细菌耐药机制复杂,许多分子检测法仅依赖于一个或两个基因的检测,实际应用时很容易假阴性,而当样本中存在无效或不完整的耐药基因,又可能产生假阳性。另外,因为现有分子技术无法检测出新型(未知)耐药机制,细菌最终的耐药表型常常是由多种耐药机制综合作用导至等原因,仅仅检测一种或数种耐药机制尚不能准确指导抗感染治疗,因此,目前分子方法应被视为一种补充而不是替代传统方法的重要工具,必须同时进行传统的基于培养的方法检测。

3.临床应用方面的问题:
在新的AMR检测技术真正走入临床,改善临床抗感染治疗之前,还需要克服许多困难:首先,检测结果需要以"可操作的方式"从临床微生物实验室传达给医生;检测价格便宜,检查报告规范易懂,并易于被临床医生执行;其次,实验室应制订合理使用检测项目的方案,并对临床医生培训,以帮助临床医生知晓,合理使用该检测项目;应用中,还应加强检验和临床的沟通,以解决临床应用时任何可能出现的问题。总之,只有当新的检测项目的结果被一线临床医生准确理解,并正确应用到临床诊治中时,才能真正发挥AMR分子诊断检测的价值。


四、展望

随着分子生物学技术的不断发展及对细菌耐药机制的认识不断加深,病原微生物AMR的检测将向着更准确、便捷、灵敏、自动化和无创性的方向发展。分子技术检测的费用也将越来越便宜。预期未来基因测序、基因芯片技术和质谱技术等检测方法将在病原微生物AMR检测领域中得到广泛的发展与应用。由于复杂细菌耐药机制导至假阴性、假阳性,机制与最终表型不一致等问题还将继续存在,基于培养的耐药性检测不可忽视。2017年出现的Accelerate Pheno System采用定时显微镜测量细菌细胞的动力学特征,包括形态学、分裂率、质量和细菌细胞暴露于特定抗菌药物下的生长率等测定该病原菌对药物的MIC值或许是未来的希望[19]

参考文献(略)

声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部