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[分享] 酶联免疫法ELISA最直白讲解

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发表于 2017-11-11 02:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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上篇文章介绍了怎么找工作,如果想找IVD方向的工作,那ELISA应该是你入门的门槛了。先说下ELISA是什么,从名字中可以看出,是两个反应(酶促反应和免疫反应)连在一起,免疫反应就是抗原抗体反应,酶促反应就是生物显色反应,目前国内常用的血液、尿液中一些指标检测方法都是这个,包括板式化学发光、胶体金(早早孕就是这个方法)也是基于这个原理的。因为抗原抗体发生了反应,你是无法看到的,所以连接上酶反应,用颜色变化来让你知道免疫反应发生强弱。目前ELISA包括直接法、间接法、夹心法、竞争法,最常用的就是间接法、夹心法。酶促反应中常用的酶是辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP),HRP是从辣根中提取的,ALP是从大肠杆菌或小牛肠粘膜提取的,底物一般为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD),还要加入过氧化氢作为催化剂。
笔者也到车间生产过ELISA试剂盒,下面就给同学们讲下,首先将抗原溶于缓冲液中,包被在96孔板上,蛋白会结合到孔壁上,之后用牛血清蛋白液封闭未结合抗原的孔壁,不然这些孔壁就会和后面的抗体结合,然后加入抗体(一抗),抗原抗体结合,这样整个ELISA反应就差不多完成了。如果是直接法,那就是抗体上连接着酶,在加入底物去和酶反应显色,最后形成孔壁-抗原-抗体-酶-底物这个形式。如果是间接法,那就一抗不连接酶,而是加入二抗,二抗上连着酶,形成孔壁-抗原-一抗-二抗-酶-底物这么个形式。如果是夹心法,那就形成一抗-抗原-二抗-酶-底物这个形式。反应完成后,用紫外分光光度计计算光度值,与标准曲线比较,得出抗体浓度值。这里多介绍下一抗、二抗,把抗原注入小鼠体内,抗原对小鼠来说是异物,小鼠体内就会抗体(一抗),再把一抗注入兔子体内,兔子体内就会产生二抗。这样再说竞争法,把抗原分别加入小鼠、兔子体内,产生鼠抗和兔抗,向抗原中加入已知浓度的鼠抗,再向抗原中加入和刚才相同浓度鼠抗和未知浓度兔抗,这样两个抗体竞争和抗原结合,鼠抗浓度减少的部分就是兔抗浓度。
在做ELISA实验时,会有很多影响因素,试剂:一定要放置室温再用,不然弱阳性样本易出现假阴。样本会受到不同影响,如内源性干扰:类风湿因子、补体,外源性干扰:溶血后,血红蛋白含铁血红素,类似过氧化物酶,会造成假阳性,染菌后,菌中含内源性辣根过氧化物酶,造成假阳性。样本保存过久,会造成假阳性。样本反复冻融,会破坏蛋白,造成假阴性。血液样本凝固不全,会造成假阳性。底物需要在用前在配置,注意避光。判读时也应在反应结束后尽快进行。做科研时,选择正确的抗原抗体,找到最好的反应浓度(防止HOOK效应),做IVD试剂盒检测时,建议用全自动设备,减少人为操作误差。反应需一次完成,中间不要暂停,另外注意洗板机是否有孔堵住,造成清洗问题。ELISA法比较成熟,不管做科研还是产品,多查查资料还是很好做的。

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发表于 2017-11-28 11:15 | 显示全部楼层
挺好,学习了。
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发表于 2018-4-2 10:27 | 显示全部楼层
学习了,谢谢
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发表于 2018-10-8 16:13 | 显示全部楼层
学习了,谢谢
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发表于 2019-3-29 16:09 | 显示全部楼层
把Elisa的各类方法讲的不错
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发表于 2019-11-7 14:14 | 显示全部楼层
学习了 讲的非常好
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