IVD检验方法简析(上）

检验之星

体外诊断(IVD)主要包括生化诊断、免疫诊断、分子诊断、微生物诊断、流式细胞诊断等。其中前三类为我国最主要的诊断方式。

生化诊断在国内和国际均已成熟，增长放缓，技术壁垒低，目前试剂已经基本完成进口替代，生化分析仪尚依赖进口，该方法面临被其他更精确快速的诊断技术完全替代的风险，国内寡头中生北控、科华生物、利德曼对市场的垄断力非常强劲。

免疫诊断经历了放射免疫、胶体金、酶联免疫(ELISA)、化学发光等阶段，目前在我国酶联免疫和化学发光并存。在多数三甲医院，化学发光已经取代ELISA成为主流，化学发光诊断仪器和试剂大多由罗氏、西门子等国际巨头提供，国内企业占比较低。

分子诊断近年来发展迅速，特别是二代、三代测序等新技术以及精准医疗新模式都大大刺激了分子诊断行业的快速增长。国内目前基因检测技术主要运用于个体化用药基因检测与无创产前DNA检测(NIPT)，两者均是未来个体化医疗的重要前提，NIPT以华大基因和贝瑞和康为代表。

酶联免疫(ELISA)

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂：

1.  固相的抗原或抗体；

2.  酶标记的抗原或抗体；

3.  酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

1.  双抗体夹心法测抗原

针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

2.  竞争法测抗原

首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。优点是快，缺点是需要较多量的酶标记抗原。

3.  免疫抑制法测抗原

被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成正比，二者之差即为预测抗原的量。

4.  间接法测抗体

是检测抗体最常用的方法，原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。主要用于对病原体的检测而进行传染病的诊断。

灵敏性高

该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

特异性强

其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

胶体金法

胶体金是金的水溶胶；胶体金法是指以胶体金为显色标记物。它的优点是操作简单，只需加入样品一个步骤，反应迅速，仅需几分钟，不需其他仪器设备，也不需要专业临检人员操作，而且携带方便，基层可以开展。  
该技术与以往常规诊断方法相比具有以下突出优点：   
1.快速：全部检测过程仅需  3-20分钟。
2.简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。
3.可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。
4.稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。
5.检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种人群的检查。  

免疫层析法( immunochromatogra-phy，ICA)

            

         是继快速免疫金渗滤法(IGFA)之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动过程中被分析物

与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。

免疫荧光法（IFA/DFA)

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

1．原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。

2．技术分类

⑴ 荧光抗体技术（荧光显微镜技术）
　　抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。

⑵ 免疫荧光测定技术：
　　抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。

（1）荧光物质:
1）荧光色素
　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：

(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：

有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

(2)四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：

最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
　　(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：

最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

（2）其他荧光物质
　　1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

　　2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+ ）、铈（Ce3+ ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。

　　Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

（3）常见荧光素：
　　1）FITC
　　2）RB200
　　3）TRITC2
　　4）镧系：Eu3+、Tb3+
　　5）PE
　　6）其它

常见荧光素的特性：
　　1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490～495nm，发射光：520～530nm，明亮的黄绿色荧光。
　　2）RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595～600nm，橘红色荧光。
　　3）TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。
　　4）镧系：Eu3+、Tb3+
　　5）PE：吸收光490～560nm，发射光 595nm，红色荧光。
　　6）其它：酶作用后产生荧光物质。
　　酶作用后产生荧光物质：

（4）合适荧光素的选择

　　1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

2）荧光效率高，标记后下降不明显。
　　3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
　　4）标记后能保持生物学活性和免疫活性
　　5）标记方法简单、快速。
　　6）安全无毒。

来源： medstartups

Mr_opD

好文好文好文