循环肿瘤细胞（CTC）的检测策略

检验之星

癌症是不可预测的。肿瘤在初次治疗后缩小，但之后可能变得更加可怕。这种疾病可能扩散，也可能突变，而遗传改变使得癌症对治疗方案更加敏感，或恰恰相反。

肿瘤学家通常依赖侵入性的活组织检查和非侵入性的成像手段来追踪肿瘤的大小、扩增以及对治疗的响应。然而，循环肿瘤细胞（CTC）带来了一种前途光明的新方法。在此，我们回顾一下分离和研究这些肿瘤风向标的方法。

CTC定义

循环肿瘤细胞是指从肿瘤上脱落并进入循环系统的癌细胞，在那里它们可以通过简单的血液检测来发现。这些细胞可作为癌症的生物标志物，指示远端是否存在肿瘤，以及它们的遗传状况和药物敏感性。与手术干预不同，CTC与纵向研究兼容，能够有效指导治疗。然而，要理解它们的意义，也没那么简单。

CTC，与肿瘤本身一样，是高度异质性的，加州大学旧金山分校的解剖学教授Zena Werb如是说。一些CTC有能力产生新的肿瘤，而另一些则没有。一些表现出癌症干细胞的特性，而另一些则不是。目前，美国FDA批准的唯一一种CTC临床检测是杨森诊断公司（Janssen Diagnostics）的CellSearch，它能有效定义上皮来源的CTC，即EpCAM、DAPI和细胞角蛋白阳性，而CD45阴性。

当然，并非所有肿瘤都来源于上皮细胞，甚至上皮肿瘤也可能逐渐丧失上皮标志物（CellSearch被批准用于转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌）。而且有迹象表明，除了癌症，炎症也可能导至血液中存在上皮细胞。Werb认为，这个故事比我们想象的要复杂得多。

据杨森诊断公司的研发部门主管Ron Mazumder介绍，血液中存在可检测CTC的患者比例随癌症类型的不同而不同。比如，结肠直肠癌、卵巢和乳腺癌大约是50-70%，而非小细胞肺癌则低至30%。这些患者体内的CTC数量也相差甚远，从单个细胞到几千个。“中位数大约是二、三十个细胞，”Mazumder谈道，但他们发现，转移性乳腺癌和前列腺癌患者中每7.5 ml血液中有五个CTC或以上的，预后情况要比CTC较少的患者糟糕得多。因此，五个被设为临界值 – 如果CTC的数量更多或更少，这对患者生存有着显著的影响，而且在多个癌症类型中都是如此。

微流体选择

原先，CellSearch完全依靠细胞计数。如今，用户也能获得这些细胞的遗传信息。2014年8月，杨森宣布与Asuragen建立伙伴关系，对分离出的CTC开展新一代测序，以鉴定几百个癌症相关基因中的突变。

CellSearch是基于阳性选择，利用抗体包被的磁珠来捕获EpCAM阳性的细胞，然后成像并计数。因此，麻省总医院癌症研究中心的助理教授Shannon Stott认为，你需要预先知道你要寻找的细胞的特性。然而，并非所有CTC都有着相同的物理和生物学性质。

Stott有着机械工程的背景，与几位同事合作，她开发出分离CTC的新方法。2010年，她开发出一种“人字形CTC芯片”，利用EpCAM抗体来捕获CTC [1]。她表示，这种设计能够比较快速地处理血液（每小时2 ml），且具有良好的灵敏度和选择性。不过，它无法解释不同的抗原谱。而捕获的细胞粘在芯片表面，使得后续培养成为问题。

2013年，麻省总医院的团队开发出第三代的技术，称为CTC¬iChip [2]。这个iChip中的i代表惯性聚焦（inertial focusing），即通过流体作用力将细胞排成一列纵队。芯片利用流体力学分选，去除最小的血液成分。然后， 它利用正向选择来去除淋巴细胞，保留剩下的一切。

据Stott介绍，iChip比人字形芯片要快得多，每小时能处理20 ml血液。它还能产生未标记的细胞，便于培养和 分析。她的同事Daniel Haber的团队从六位乳腺癌患者中建立了CTC细胞系 [3]。对这些细胞系的测序鉴定出 新获得的突变和药物敏感性，这些信息能帮助开发更好的治疗策略。在另一项研究中，Haber的团队对分离出 的CTC开展单细胞RNA¬seq，并将它们与同一位患者的CTC聚集体进行比较，以了解这些成簇CTC结构的性质 [4]。与单独的CTC相比，成簇的CTC有着更大的转移潜力。分析鉴定出一个细胞连接相关基因，称为 plakoglobin。

目前，杨森诊断公司正与麻省总医院的团队合作，希望将iChip转化成新一代的CTC分析平台。

CTC成像

《Nature Reviews Clinical Oncology》上的一篇文章回顾了CTC分析和鉴定的原理 [5]。文章中有一个表格， 列出了精选的检测技术，其中大部分是基于CTC的抗原谱或物理性质。表格中提到的一种替代策略是图像流式 细胞仪，这种方法由默克密理博商业化。

ImageStream和FlowSight都是图像流式细胞仪，本质上就是带有照相机的流式细胞仪。随着每个细胞通过， 它在明场和暗场模式以及多达10个荧光通道下成像，产生每个细胞的12幅图像，且每秒能成像2,000个细胞。 这两个平台之间的差异是ImageStream能放大到60倍，而FlowSight提供固定的20倍放大。

尽管所得到的细胞无法培养，但是当细胞通过系统时，用户也能开展各种分析。例如，他们可以对细胞外和细 胞内标记进行染色，以确定细胞的来源，或者用RNA¬FISH探针染色，对转录本进行计数。

当然，传统的流式细胞仪也能获得许多参数，而图像流式细胞仪能为你带来自信，这少少的阳性细胞正是 CTC。“眼见为实，”默克密理博细胞分析的高级总监David Basiji说道。如今，这家公司正在努力实现CTC的分 离，便于下游研究的开展。

参考文献

[1] Stott, SL, et al., “Isolation of circulating tumor cells using a microvortex¬generating herringbone¬chip,” Proc Natl Acad Sci USA, 107:18392–7, 2010. [PubMed: 20930119]

[2] Ozkumur, E, et al., “Inertial focusing for tumor antigen¬dependent and –independent sorting of rare circulating tumor cells,” Sci Transl Med, 5:179ra47, 2013. [PubMed: 23552373]

[3] Yu, M, et al., “Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility,” Science, 345:216–220, 2014. [PubMed: 25013076]

[4] Aceto, N, et al., “Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis,” Cell, 158:1110–22, 2014. [PubMed: 25171411]

[5] Krebs, MG, et al., “Molecular analysis of circulating tumour cells—biology and biomarkers,” Nat Rev Clin Oncol, 11:129–44, 2014. [PubMed: 24445517]

来源：生物通

检验之星

1. 循环肿瘤分子特征分析

  英国癌症中心发表在NatureReviews上的综述，全面的介绍了CTC经历EMT机制入血到形成转移灶的过程中CTC的分子特征的的变化。Matthew G. Krebs指出：CTC分析技术可以用于评估肿瘤异质性和疾病进程，在治疗过程中，身体中占支配地位的CTC是不断变化的，伴随治疗耐药的出现，耐药性CTC逐渐在治疗后增多。CTC的分析可以通过动态监测肿瘤细胞的变化，实时、动态的反映患者的治疗状况及疾病进程，为目前的肿瘤治疗监测提供很好的补充。

2. CTC培养用于药物敏感性试验

  哈佛医学院的研究人员发表在science上发表的一项研究，研究通过体外培养循环肿瘤细胞，并将其用于基因测序和药物敏感试验。

  哈佛医学院的Daniel Haber从36个患者样本中分离出了CTC细胞，并通过体外培养建立了细胞系。这些细胞系完整的保留了原始的细胞形态和特征，动物试验显示这5个CTC细胞系中有3个检测到小鼠致瘤。

  研究人员药物敏感性试验发现CTC药物敏感性测量结果与临床病史一致，包括紫杉醇和卡培他滨的敏感性、氟维司群和阿霉素的耐药性。随着CTC培养条件的优化，这个策略可以帮助恶性肿瘤患者在整个疾病过程中接受最好的治疗。

3. 循环肿瘤细胞团

  由哈佛大学完成的一项关于循环肿瘤细胞团的研究发表在cell，该项研究中研究人员通过示踪标记乳腺肿瘤的小鼠模型，发现CTC细胞团是由单克隆肿瘤细胞群形成而不是在血液循环中聚集形成。虽然血液中CTC细胞团相对单个CTC而言较为稀少，但是其形成转移的潜能是单个CTC的20~50倍。该项研究说明循环肿瘤细胞团有更大的转移潜能，是单个CTC转移潜能的20~50倍。

4. CTC表型和核型分析的临床意义

  由北京大学肿瘤医院完成的一项关于循环肿瘤细胞表型和核型分析的研究发表在Oncotarget，研究人员通过阴性富集技术结荧光原位杂交技术检测CTC，进一步分析胃癌CTC中人表皮生长因子受体（HER2）表达及8号染色体非整倍体。

  该项研究结果显示CTC水平的HER2检测与靶向治疗用药相关，CTC核型分析表明8号染色体不同倍体对于紫杉醇、顺铂化疗敏感或耐药存在相关性。根据CTC 8号染色体核型或者HER2 表达可以监测胃癌患者化疗耐药以及评估治疗疗效。