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宏基因组学技术助力病原体精准诊断

2019-10-9| 编辑: 面气灵| 查看: 223| 评论: 0|来源: 临床实验室

摘要: 感染性疾病是指由致病微生物通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的一类疾病的统称,《2018年中国卫生健康统计年鉴》显示,2017年全国综合医院的门急诊人次约为33.6亿,住院人数2.44亿,有近1/3是感染性疾病 ...


感染性疾病是指由致病微生物通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的一类疾病的统称,《2018年中国卫生健康统计年鉴》显示,2017年全国综合医院的门急诊人次约为33.6亿,住院人数2.44亿,有近1/3是感染性疾病,是发病率最高的病种之一。除了发病率高,影响严重之外,感染性疾病的诊疗过程中伴随着大量经验性抗菌类药物的使用,迅速引发了全球范围的抗生素耐药和“超级细菌”的诞生。


病原学快速诊断、溯源和用药选择是遏制感染性疾病传播和细菌耐药发展的关键。临床对微生物的鉴定方法分为培养和非培养两类,公认的金标准方法是分离培养和生化鉴定,这种方法的操作周期长、失败率高,并且不是每种病原体都可以培养;不依赖培养的镜检、抗体抗原免疫等方法,在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强,但在准确性上存在明显劣势。


近年来,基于核酸检测的分子诊断技术发展迅速,几乎所有的病原体都含有核酸(DNA或RNA),而且核酸序列具有显著的物种特异性,对感染患者样本中的核酸进行检测可以准确反映病原微生物的种类和含量。宏基因组测序(metagenomic Next-Generation Sequencing,mNGS)直接对样本中的核酸进行“鸟枪法(shotgun)”大规模平行测序,得到的序列信息与已知微生物数据库比对分析,判断样本中微生物的种类和含量。理论上,mNGS可以报告所有已知基因组序列的病原体,为危重和疑难感染患者的临床诊断提供了行之有效的技术手段。由于mNGS检测准确与全面的优点,相关的技术标准和临床应用指南被陆续发表,标志着以病原高通量测序技术为代表的微生物检测技术已经深入临床,有着广阔的临床应用前景。高通量测序为细菌耐药性的检测和监测提供了新机遇,目前已有许多与抗生素耐药性相关的基因数据库,比如Comprehensive AntibioticResistance Database(CARD),整合了4000多个抗性基因,涉及了外排泵、失活酶、阻遏物、底物丢失等多种耐药机制。通过高通量测序获得样本中微生物的核酸序列与CARD数据库进行比对,可以获取样本中耐药基因的种类、拷贝数和溯源信息。



mNGS临床应用需解决的问题

1)时效性: mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理,操作步骤包括但不限于:核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控、pooling等。再加上测序反应和数据分析,整体流程复杂、耗时长,自动化程度低。核酸在扩增后有可能产生气溶胶污染,而大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤,因此实验室在防止污染和质量控制上需要建立一系列标准化SOP。由于技术本身的复杂性,目前mNGS多以送检为主,样本周转时间(TAT)一般为72小时。而对危重感染患者而言,时间就是生命。如何进一步缩短TAT,尽快汇报结果,是亟需解决的问题之一。

2)准确性: mNGS可以覆盖10000种以上病原体,灵敏度很高。实际检测中,这是一把双刃剑,因为临床取样、运输、样本处理、上机测序等各个环节中都有可能受到环境、容器和试剂中的微生物核酸污染。另一方面,人体含有定植性微生物(不同个体、不同样本类型,定植微生物的种类和丰度有较大差异)。这些因素都会导至结果中混有非致病性微生物。因此,如何能结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原体,是必须攻克的难题。

3)检测DNA or DNA+RNA: 众所周知,一些病毒的基因组为RNA,用DNA建库的方法不能检出。此外,RNA与DNA的测序结果可以互为确认和补充。同时,RNA丰度与基因转录活跃程度正相关,检测RNA可以识别死菌和活菌,区分既往和现行感染。因此,DNA+RNA测序与单纯的DNA测序相比具有多重优势,尤其在儿童感染中有较大需求。但人源RNA比DNA有更高的丰度和复杂度,且RNA易降解,对样本运输和保存有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检测,是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。


小 结

mNGS是一项潜力巨大的检测技术,随着测序平台、实验操作、数据分析流程的完善和临床研究的深入,mNGS必定会为急危重症和疑难感染患者提供精准的病原体诊断依据,辅助临床医师在第一时间了解病因,制定治疗方案,挽救患者生命。

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