化学发光的AP和AE，到底选谁？

化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析法的结合。它同时具有化学发光的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。二者的结合是通过将化学发光反应试剂（如吖啶酯，碱性磷酸酶等）与抗体或抗原标记，标记后的抗体或抗原与待测物经过一系列免疫反应，理化步骤（分离、洗涤等），最后测定发光强度，间接确定待测物含量。化学发光标记物的选择，决定了反应体系的特性，也决定了仪器特性，试剂特性等。我局就常用的化学发光标记物吖啶酯和碱性磷酸酶做了一期梳理。

主要的化学发光免疫分析法根据其标记物不同大致可分为三类，直接化学发光，酶促化学发光，以及电化学发光。

直接化学发光是用发光分子，如吖啶酯，鲁米诺类等，标记抗体或抗原。这类小分子的特点是能够在特定条件下被激发发光，因此称之为直接化学发光。通常用于直接化学发光标记分子如吖啶酯，分子量较小，标记过程中对抗体抗原的改变程度较小。采用吖啶酯直接化学发光的厂家是雅培、西门子。

另外一种广泛使用的是酶促化学发光。酶促化学发光将辣根过氧化物酶（HRP），或碱性磷酸酶（AP）等与抗体或抗原偶联，免疫反应后，通过酶催化底物发光，因此也常被称为间接化学发光。采用酶促化学发光的代表厂家是贝克曼。

电化学发光也被广泛应用于化学发光免疫分析方法中，并且因为罗氏诊断在IVD领域内的巨头地位而尤其著名。电化学发光中最为常用的标记物是联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+及其衍生物。在工作电极上，反应体系中的三丙胺变为具有强还原性的自由基三丙胺，[Ru(bpy)3]2+释放电子成为具有强氧化性的三价[Ru(bpy)3]3+。二者随后发生氧化还原反应，释放出一个波长为620nm的光子。整个反应过程是一个循环过程，测定信号不断放大。凭借着专利优势，罗氏诊断在电化学发光领域拥有绝对的话语权。随着近些年来专利到期，国内也有厂家开始开发电化学发光免疫试剂，如深圳普门，北京联众泰克等。

△三种不同化学发光类型示意图

化学发光可以分为三大类，那么市场上化学发光厂家是如何选择的呢？我们对国内主要的化学发光厂家，以及国际上的化学发光厂家作了统计分析。其中国内一共统计了69个化学发光平台，国际14个发光平台。就国际四大家中，罗氏诊断采用电化学发光，雅培采用吖啶酯直接化学发光，贝克曼采用碱性磷酸酶-AMPPD发光系统。西门子由于历史原因，qixia三个平台，Centaur平台采用吖啶酯直接化学发光，IMMULITE平台采用碱性磷酸酶化学发光，DIMENSION采用均相光激化学发光。

△化学发光平台分布图

总体上看，本次统计当中，采用碱性磷酸酶的化学发光厂家最多，一共有32个平台，占比超过三分之一；其次是吖啶酯化学发光，有23个平台采用吖啶酯直接化学发光。如果算上吖啶酯、碱性磷酸酶兼容的开放性化学发光平台，采用碱性磷酸酶或吖啶酯的化学发光平台达到了63个，占比高75%。由此可见，目前市场上主流的是碱性磷酸酶和吖啶酯化学发光平台。其次是辣根过氧化物酶（HRP）系统，一共有8家，包括奥森多、安图这样的国际、国内巨头。电化学发光由于专利知识产权问题，该领域一直牢牢被罗氏占据。随着专利的到期，国内已经开始出现了采用电化学发光的厂家，其中以深圳普门、北京联众泰克为代表。深圳普门从2017年开始申请电化学发光免疫测定试剂盒注册证，至今已经拿到了17个注册证。北京联众泰克2018年电化学发光免疫测定仪UD90DT申请获得注册证，2019年获得了20个电化学发光免疫测定试剂盒注册证。

△国内代表性电化学发光厂家注册证列表

△碱性磷酸酶（AP），吖啶酯（AE）特点简单对比

碱性磷酸酶（AP）化学发光与吖啶酯直接化学最大的区别在于，碱性磷酸酶是催化底物如AMPPD发光，属于辉光型（进入发光平台期，持续发光）。吖啶酯是直接化学发光，在双氧水与氢氧根作用下水解发光，属于闪光型（发光值在0.5s左右进入最高值，1s内发光结束）。因此，吖啶酯直接化学发光对于仪器的要求更高，需要原位加入激发液，并且在1s内完成读数。

△吖啶酯-闪光型发光，碱性磷酸酶-AMPPD辉光型发光

碱性磷酸酶的一个缺点是，酶与底物需要孵育反应一段时间，发光值才能达到平台期。特别是AMPPD，需要孵育5min才能达到发光平台期，与吖啶酯直接化学发光在1秒内完成测试相比，多少会影响检测速度。另外一种新型碱性磷酸酶底物，Lumigen APS-5能够在30秒内达到发光平台期，但是由于其对温度敏感，并且长期稳定性较AMPPD差，因此暂时没有广泛应用在化学发光系统中。作为碱性磷酸酶化学发光的领先者，贝克曼已经解决了APS-5稳定性问题，并且在今年申请了全球专利。也许在不久的将来，贝克曼将会把底物切换成更为先进的APS-5，以提升竞争力。

要建立一个新的化学发光免疫分析平台，需要选择一个合适的发光类型，是直接化学发光，还是酶促化学发光，或者是电化学发光。从目前看，大多数公司选择碱性磷酸酶，或者吖啶酯直接化学发光。从试剂开发角度上看，吖啶酯可能会较碱性磷酸酶稍微有优势一点，一个例子就是迈克生物，迈克生物2018年之前采用辣根过氧化物酶标记抗体，自2018年后，转向吖啶酯直接化学发光，2018年，2019年已经获得了26个注册证。但是从整体上看，二者之间并没有明显的差距，贝克曼，迈瑞等巨头采用碱性磷酸酶，也能够在主流市场取得领先地位。因此，化学发光平台的选择，是一个需要综合考虑的问题，需要整体考虑人才的可获得性，试剂、仪器的综合难度，以及投入成本，试剂成本等。

【厂家-发光平台总表如下】