糖化血红蛋白检测及其在糖尿病诊疗中的应用

糖尿病是一种严重的、慢性的代谢性疾病，系胰岛素相对不足或绝对不足，或利用障碍引起。各种类型的糖尿病会引起多种并发症。根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)的报告^[1]，2017年全球成人糖尿病(20～79岁)患者4.25亿，占全球成人人口的8.8%。其中因糖尿病致死400万人(20～79岁)，糖尿病治疗费用7 270亿美元。预计到2045年，全球成人糖尿病患者将达到6.29亿，占全球成人人口的9.9%，糖尿病治疗费用将达到7 760亿美元。

2016年，WHO^[2]公布的我国糖尿病患病率为：男性10.5%，女性8.3%，合计9.4%。因糖尿病致死的死亡人数占所有死亡人数的2%，其中不包括因高血糖致死的死亡人数。

我们通常以空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)和口服糖耐量实验(oral glucose tolerance test，OGTT)结果作为糖尿病筛查、诊断和监测指标。然而，FPG和OGTT有如下缺点：(1)反映即时血糖水平，仅代表个体内血糖水平的一个点，无法全面了解一段时间内血糖的控制情况；(2)生物学变异较大；(3)受糖酵解、白细胞总数等因素影响明显；(4)OGTT操作复杂，多次抽血耽误患者就诊时间，患者依从性较差。因此，临床上需要寻找一个能够弥补这些缺点的检测指标。

1968年，伊朗学者Ranbar等^[3,4]从糖尿病患者红细胞中发现了异常的血红蛋白。1983年，美国卫生和公共服务部(the United StatesDepartment of Health and Human Services，HHS)、美国卫生研究院(the National Institutes of Health，NIH)下属的美国糖尿病、肾病、消化病研究院共同展开了为期9年的美国糖尿病控制与并发症研究(the Diabetes Control andComplications Trial，DCCT)^[5]。研究结果显示，糖化血红蛋白可以作为糖尿病病情监测或其预后判断的重要指标。1998年，英国针对2型糖尿病开展了为期10年的英国糖尿病前瞻性研究( U . K . Prospective Diabetes Study，UKPDS)^[6]。其研究结果与DCCT一致，即HbA1c每降低1%，任何糖尿病相关终点事件的发生风险下降21%；糖尿病相关死亡风险降低21%。正是鉴于DCCT和UKPDS的研究成果，奠定了HbA1c作为糖尿病疗效监测指标的地位。

1996年，美国国家糖化血红蛋白标准化计划(National Glycohemoglobin StandardizationProgram，NGSP)作为美国CDC下属的行政管理机构，开始展开HbA1c的标准化工作，但NGSP的Bio-Rex70树脂HPLC与瑞典推荐的Mono S HPLC、日本的HPLC均有差异，而且没有推出参考系统应有的参考方法和参考物质，因此，当时的标准化工作实质上只能作为一致性工作。

1995年，国际临床化学与医学实验室联盟(International Federation of ClinicalChemistry and Laboratory Medicine，IFCC)为实现全球HbA1c结果的统一，成立了标准化工作组。2002年，IFCC批准了高效液相色谱-电喷雾质谱法与高效液相色谱-毛细管电泳法为参考方法。2007年，欧洲参考物质和参考测量研究院批准并发布了IRMM/IFCC-466参考物质。至此，有了参考方法、参考物质、参考区间和参考实验室这一参考系统，HbA1c的标准化才实现了真正意义上的标准化工作。同年，美国糖尿病协会(AmericanDiabetes Association，ADA)、欧洲糖尿病研究学会(European Association for the Study of Diabetes，EASD)、IDF和IFCC发表联合声明^[7]，承认NGSP的结果可溯源至IFCC参考方法，标志着美国NGSP与IFCC参考方法的结果实现了统一。

2010年和2011年，ADA^[8]和WHO^[9]分别建议将HbA1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准之一。由此，解决了HbA1c作为诊断指标的切点问题。同时，HbA1c还具有以下优点：(1)反映长期血糖水平；(2)可作为慢性并发症的风险指标；(3)生物学变异较小，不受血糖波动、应激的影响；(4)药物影响小；(5)无需空腹或特定时间抽血，节约患者时间，患者依从性好。

(一)糖化血红蛋白检测技术的分类及评价

HbA1c检测技术繁多，目前临床常用的检测方法可分为两大类。一类利用糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白电荷差异进行分离，包括：离子交换HPLC、毛细管电泳法、等点聚焦电泳法等；另一类则利用血红蛋白糖基化基团与非糖基化基团结构的不同开展检测，包括：硼酸盐亲和层析法、免疫法和酶法。

离子交换HPLC作为DCCT和UKPDS的推荐方法，具有精密度和准确性良好、方便快捷、干扰因素较小等优点。其缺点在于成本较高，部分产品受血红蛋白浓度和血红蛋白变异体的影响。卫生部临床检验中心室间质评结果显示，采用该方法的实验室从2013年的278家上升到2018年的1 284家，显示近年来离子交换HPLC在我国临床实验室得到广泛应用。

毛细管电泳法是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离分析技术，可分离HbA2、血红蛋白C(HbC)、血红蛋白E(HbE)、血红蛋白S(HbS)、血红蛋白D(HbD)、胎儿血红蛋白(HbF)、HbA0，以及其他血红蛋白和HbA1a、HbA1b、HbA1c。该方法具有所需标本量少、可自动化、重复性好、可用于β-地中海贫血^[10]以及其他血红蛋白合成障碍性疾病的筛查等优点，但存在检测成本较高、检测速度慢等缺点。

硼酸盐亲和层析法则利用m-氨基苯硼酸与结合于血红蛋白的葡萄糖顺位二醇基发生特异性反应，该方法检测总的糖化血红蛋白，包括HbA1c和其他位点的糖化血红蛋白。其优点在于所需标本量少、检测速度快、可用于POCT、受血红蛋白变异体影响最小。其缺点在于受HbF影响，无法发现Hb变异体。

大多数免疫测定法能特异地识别血红蛋白β链N端糖基化的氨基酸(通常是开始的4～10个氨基酸)，免疫法又可分为免疫化学发光法、免疫比浊法、乳胶凝集法和免疫层析法。该方法优点包括：特异性高、可自动化、成本低廉、无Hb变异的干扰。缺点在于：受乳糜血和胆红素影响，无法发现Hb变异体。

酶法则使用一种特异性酶酶切N端缬氨酸来测定HbA1c。由于采用比色法，该方法不需要昂贵、精密的检验仪器，实验室常用的全自动生化分析仪即可完成检测。其优点在于：方便快速、成本低廉。但目前国内不同厂家生产的试剂质量良莠不齐，不同检测系统间的精密度和准确性差异明显。建议临床实验室在引入该方法前严格开展性能验证工作，验证能否满足临床要求。

鉴于离子交换HPLC为每个患者样品提供了一张便于判断的层析图，很多临床实验室将其作为检测HbA1c的首选方法。但该方法受血红蛋白变异体的影响，会掩盖HbA1c而导至结果错误。因此，有专家提出，实验室采用离子交换HPLC检测HbA1c时，应选用两种检测方法^[11]。审核离子交换HPLC结果前，首先筛查层析图是否存在异常血红蛋白，如果存在，则可以选择免疫法或毛细管电泳法进行复查，确保HbA1c检测结果准确。

(二)糖化血红蛋白检测中的干扰问题

在糖化血红蛋白检测过程中，多种因素均会引起血红蛋白数量与质量变化，最终干扰HbA1c的检测结果。

1．生理因素：

如种族差异^[12]、年龄差异^[13]、性别差异^[14]，地区差异(高原与平原地区)和妊娠^[15](妊娠中期女性HbA1c水平略降低，而妊娠晚期略升高)。

2．病理因素：

任何引起红细胞寿命延长或缩短的疾病，均可造成HbA1c的检测结果假性升高或假性降低。脾切除、再生障碍性贫血、维生素B12缺乏及肾损伤等疾病造成HbA1c结果的假性升高；溶血性贫血、大量失血、脾肿大、风湿性关节炎及慢性肝脏疾病等造成HbA1c结果的假性降低。与此同时，各种导至高甘油三酯血症和高胆红素血症的疾病可造成HbA1c水平的升高^[16]。

血红蛋白病和血红蛋白变异体^[17]也会影响HbA1c的检测结果。常见的血红蛋白变异体包括HbS、HbE、HbC、HbD，在全球范围内：HbS、HbE、HbC、HbD的分布依次减少。此外，HbF也是影响HbA1c的检测结果的常见因素。NGSP列出了常见血红蛋白变异体对不同检测系统的影响，并每年进行更新^[18]。

3．药物的影响：

如长期大剂量服用维生素C和维生素E会造成HbA1c的检测结果假性偏低；而长期大剂量服用乙酰水杨酸盐、慢性麻醉剂、羟基脲、嗜酒会导至结果假性升高^[19]。

(一)国外糖化血红蛋白在糖尿病诊断和管理的应用情况

严格开展糖尿病监测和管理工作能延缓糖尿病患者并发症的发生，降低相关死亡风险。患者处于未诊断和未治疗的高血糖状态，时间越长则预后越差^[1]。因此，WHO^[2]和各国都在探索糖尿病的筛查、诊断和管理方法。

2009年，日本学者Seino等^[20]建议将HbA1c纳入糖尿病诊断标准。2010年，ADA^[8]将HbA1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准之一，但需要排除血红蛋白病、衍生血红蛋白、红细胞寿命和药物等因素影响。同时，提出在糖尿病筛查和管理中，HbA1c具有重要作用。2011年，IDF也提出将HbA1c纳入糖尿病诊断和管理标准。2011年，WHO^[9]建议各国和地区，在条件允许的情况下，可将HbA1c≥6.5%作为糖尿病诊断标准之一。2014年，德国医学协会^[21]也将HbA1c纳入糖尿病诊断和管理标准中。2017年，针对2型糖尿病管理，IDF^[22]推荐将HbA1c控制在7%以内，尽可能避免超过8%。2018年，ADA颁布的《2018年糖尿病诊疗标准》^[23]中，除保留HbA1c作为糖尿病的诊断标准外，同样对HbA1c用于糖尿病监测和管理提出建议^[24]：(1)满足血糖控制目标的糖尿病患者(血糖控制稳定)，每年至少监测2次HbA1c；(2)未满足血糖控制目标或治疗方案有变化的糖尿病患者，每年至少监测4次；(3)HbA1c在POCT中的应用，能及时地提供更多调整治疗的机会。

目前，日本、美国、欧洲和WHO已先后将HbA1c纳入糖尿病的诊断标准中，同时针对不同人群，提出不同的监测和管理方案，便于开展不同的治疗。

(二)国内糖化血红蛋白在糖尿病诊断和管理的应用情况

在我国，尤其在基层医院，临床医生和糖尿病患者对HbA1c重要性的认识仍然欠缺，HbA1c在糖尿病管理上的作用没有得到很好的应用。早在2010年，为推进HbA1c在我国广泛和正确使用，促进HbA1c检测方法的标准化，由中华医学会科普部"糖尿病防治技术筛选和普及研究课题组"牵头，卫生部临床检验中心作为协作单位共同启动"中国糖化血红蛋白教育计划"。该计划希望通过在临床医生、糖尿病患者和临床检验人员中开展持久和广泛的教育活动来提高我国糖尿病的诊断、治疗和管理水平。目前，该计划已进行到第三期。

2014年，糖化血红蛋白测定专家共识委员会达成我国《糖化血红蛋白测定专家共识》^[25]，在形成的39条共识中，对HbA1c检测频率、检测方法的干扰、报告方式、方法学选择、质量控制和室间质量评价等方面提出了要求。

近年来，我国临床医生逐渐关注HbA1c的应用，他们认为如果临床实验室采用标准化方法，严格质量控制，其结果可以用于糖尿病的诊断。但由于不同检验机构，尤其是基层检验机构的溯源性(正确性)和稳定性存在较大问题^[26]，导至HbA1c尚未纳入糖尿病的诊断标准中。时至2018年，我国中华医学会糖尿病学分会发布的《中国2型糖尿病防治指南(2017版)》^[27]，HbA1c仍未能纳入糖尿病的诊断标准。但可喜的是，该指南已将HbA1c纳入糖尿病患者的治疗和管理工作中。当HbA1c分别小于7.0%、7.5%、8.0%、8.5%和9.0%等不同医学决定水平时，提供了不同的治疗与管理方案。

诚然，我国的HbA1c检测工作尚面临许多问题^[28,29]，仍有医疗机构和实验室采用非标准化的检验方法进行HbA1c检验。卫生部临检中心室间质量评价数据显示，低压液相法历年结果的CV为5.67%～79.35%。这种不稳定的检测系统，阻碍了我国HbA1c的标准化进程，妨碍了HbA1c在临床中对糖尿病诊断和管理的正确使用，这也是我国临床医生诟病已久的问题。希望通过检验和临床的通力合作，正视并降低HbA1c检测过程中各种干扰因素对检验方法的影响，提高各级检验机构检测系统的精密度和准确性，实现HbA1c检测结果的标准化。满足临床工作者在糖尿病诊断、管理及治疗过程中对HbA1c检测结果的质量需求。

选自中华检验医学杂志2018,41(11)