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侧向免疫层析的“探针”新机遇

2019-4-17 23:44| 编辑: 小桔灯网| 查看: 3812| 评论: 0|来源: 生物医学知识局丨作者:疯帽子

摘要: 在谁将成为国内侧向免疫层析检测(POCT)的巨头?(点击可直接进入该文章)中,曾对侧向免疫层析(Lateral flow immunoassay,LFIA)检测技术的基本原理和发展现状做过比较系统的介绍。如今有超过一半的厂家选择荧光 ...

谁将成为国内侧向免疫层析检测(POCT)的巨头?(点击可直接进入该文章)中,曾对侧向免疫层析(Lateral flow immunoassay,LFIA)检测技术的基本原理和发展现状做过比较系统的介绍。如今有超过一半的厂家选择荧光作为标记探针。



其中,我们最为熟知的胶体金法试纸条就是利用颜色信号进行检测,但其灵敏度较低,无法完全满足实际应用的需求。因此,研究者们开发了各种纳米颗粒,以改善LFIA的性能。大致可分为颜色颗粒、发光颗粒和磁颗粒三种类型(下图)。纳米颗粒的制备和修饰技术的进步,以及配套检测设备的开发,推动着检测信号的进化,这不仅提高了试纸条检测水平,也是对当前市场上LFIA产品进行分类和比较的重要标准。


基于纳米颗粒的各种超敏LFIA示意图(Ref:Huang X, et al. Biosensors& Bioelectronics, 2016, 75:166-180.)


接下来我们重点看一下,在LFIA中会有哪些不同类型的纳米颗粒?它们会有怎样的应用以及原理是什么?

有色纳米颗粒系列

金纳米颗粒/GNPs


目前,传统的胶体金法试纸条具有判读简单、发展成熟等独特优势,在市场中仍然扮演着重要的角色。金纳米探针在T/C线上累积显色,可用肉眼直接判读。但这种方法仅能提供定性或半定量的检测结果,而且用肉眼对条带进行视觉判读,也容易出现人为误差。利用检测仪器将颜色密度转化为光密度(opticaldensity,OD),则可对信号进行准确量化。相比单独读取T线的OD值,读取并计算T线和C线的OD值之比能够更好地抵消反应时间、温度、条带之间差异等因素的不良影响。


受球形GNPs尺寸(通常为20-30nm之间)、信号强度等的限制,胶体金法的灵敏度偏低。控制GNPs在一定程度上聚集,制备复合体,可获得比单个GNP的红色更强的深紫色信号,如以氧化铁或二氧化硅纳米颗粒为核,在表面包被GNPs壳层。金/银染色是另一种为人们所熟知的信号增强方法,金/银离子被还原并沉积在T/C线的GNPs表面,使颜色信号增强。但该方法需要另外的染色和洗涤步骤,或者特殊设计的试纸条结构。与金/银染色思路类似,酶催化显色的方法也广泛应用于生物传感和测试,GNPs上同时标记抗体(或DNA单链等)和辣根过氧化物酶,免疫反应完成后加入底物显色,实现T线信号的增强。


基于使用双重GNPs进行信号增强的做法则是在传统胶体金试纸条基础上加入信号放大金探针,该探针负载有二抗或链霉亲和素等,特异性靶向用于检测的金探针,可有效增加T线上累计的GNPs数量,从而提高检测灵敏度,该方法一般配合双结合垫使用,信号放大探针和检测探针分别固定在各自的结合垫上,被待测样品溶解释放后才有机会接触和反应。


有色纳米颗粒系列

其他纳米颗粒


碳纳米颗粒(胶体碳,炭黑),也是一类在肉眼观察时即可实现定性或半定量检测的颗粒。碳纳米颗粒易于制备,性质稳定,无毒副作用,易结合,可作为金纳米颗粒的替代物。值得一提的是,碳纳米颗粒具有很高的信噪比,在一些研究中,即使使用肉眼观测也能达到皮克级别的灵敏度。


另外也有文献报道,采用胶体硒纳米颗粒。这是一类肉眼可见的铁锈色颗粒,也可作为LFIA的显色标签使用。但根据现有的研究结果,其灵敏度、准确度、重复性等各方面指标弱于使用其他纳米颗粒的层析体系,因此应用前景不甚乐观。


发光纳米颗粒系列

半导体量子点


量子点(quantum dots,QDs)是一类荧光半导体纳米晶体,由于具有尺寸依赖的发射光谱、激发谱宽、发射谱窄而对称、荧光强度高寿命长、光稳定性好等一系列独特性质,被认为是最有前景的免疫分析信号标签之一,已被用于检测药物、毒素、病原体等。


利用不同激发/发射波长的QDs,可在一个试纸条上同时检测多个指标。与传统LFIA多个指标需要对应多个T线不同的是,基于QDs的多重检测可在仅设置一条T线和一条C线的前提下实现。一种有趣的意在提高检测灵敏度的做法是将未标记的高荧光产率的QDs事先固定在T线上,探针上携带直接或处理后使荧光淬灭的物质,层析完成后,通过QDs的淬灭程度判读结果。QDs在生物环境中性能不够稳定,这可能影响检测结果的准确度。将QDs掺杂或封装到纳米珠中,可以得到增强的化学和胶体稳定性,同时也可以实现检测信号的放大。


目前国内分别有重庆新赛亚江苏量点科技南京诺唯赞深圳金准等公司采用量子点作为标记探针,应用于LFIA当中。其中南京诺唯赞公司在其量子点荧光免疫层析平台成功开发出高敏心肌肌钙蛋白I检测试剂盒,功能灵敏度达到0.02ng/mL,最快8min出结果,并且在2018年9月成功取得注册证。



发光纳米颗粒系列

上转换发光纳米颗粒/UCPs


UCPs可在低能的红外光激发下发射高能的可见光或紫外光,具有较高化学稳定性和光稳定性,输出波长可调谐等优点。尤其是UCPs可有效降低光致电离作用引起的基质材料的衰退,因此其长的荧光寿命(毫秒级)可以有效减少背景荧光干扰,降低信噪比。UCPs在免疫分析中的应用较晚(2000年之后),但发展较快,目前限制其应用的主要因素是量子产率低,光功率密度低的激发光源会大大降低激发效率。因此,研发高激发能的、可用于上转发光的便携设备是近来研究者们努力的方向。


发光纳米颗粒系列

荧光纳米颗粒


二氧化硅纳米颗粒(Silica nanoparticles,SNPs)粒径分布广,生物相容性好,表面基团丰富易修饰。虽然自身没有荧光,但可在材料内部掺杂各种荧光染料分子获得荧光性能,已成功掺杂的染料分子包括但不限于荧光素、罗丹明、Alexa Fluor647、镧系元素螯合物、联吡啶钌等。与基于高分子的纳米颗粒不同,SNPs不易聚集,染料泄露极低,非常适合免疫分析。条件适宜时,单个SNP中可以掺杂进大量的染料分子(可高达数万),尽管有荧光淬灭的现象,但掺杂染料的SNPs仍能产生高度放大的荧光信号。SNPs内部的染料分子被保护不易受环境影响,光漂白也被最大程度降低。举例来说,镧系元素螯合物如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)等,具有独特的发光特性,如荧光寿命长、斯托克斯位移大、发射谱窄和原子态发光,已在低浓度待测物的免疫检测中得到了广泛应用,但发光弱和光漂白的影响使它们的应用受限。而将SNPs与镧系元素螯合物掺杂,可有效增强荧光性能,提高检测灵敏度。铕掺杂的SNPs已普遍用于时间分辨免疫荧光技术,与传统技术通过波长分辨信号和背景不同,该技术利用荧光寿命区分二者,可获得更好的信噪比。


聚苯乙烯纳米颗粒,形貌均一,性能稳定,易于制备,价格低廉,也常用于掺杂荧光,与SNPs类似,荧光掺杂的聚苯乙烯纳米颗粒与单个荧光分子相比,可产生更强荧光信号,改善LFIA的分析性能。


磁纳米颗粒系列

磁纳米颗粒


光学LFIA的定量分析主要通过仪器检测膜材的反射光或发射的荧光来实现,这种手段只能获取T/C线部位膜材表面产生的信号(约10μm),而免疫反应是在厚度达几百微米整个膜中——包括膜表面和膜内——进行的,约90%的信号不能被仪器有效捕获,被白白浪费掉。此外,和其他的光学传感器一样,光学LFIA容易受到镜面反射、散射等光学作用的干扰,信号的淬灭和变化也不利于长期保存。因此,磁纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)被开发为新型的层析标签。


与传统LFIA不同,磁性LFIA的设备可以读取检测区全部的磁信号,从而实现高灵敏度的定量检测。基于磁信号的稳定性,试纸条可以保存起来,用于重复测试核对结果,生物样本对背景的干扰也较低。磁性LFIA的定量分析主要基于两种策略。一是在振荡磁场中,利用巨磁阻传感器测量T线上所有MNPs的饱和磁化强度。巨磁阻传感器可以设计得很小,以匹配待测颗粒的尺寸,使对单个磁标签(single-magnetic-lable)的检测更容易。二是在磁场中分别测量膜上不同区域产生的磁通量。


西安金磁纳米是国内唯一一家采用磁纳米颗粒作为免疫层析探针的。在2013年,西安金磁申请了金包磁的国家专利,通过在磁纳米颗粒包被一层金纳米颗粒,能够有效提高磁纳米颗粒的稳定性和生物相容性。但是读取磁信号的POCT磁定量免疫分析仪GM-MICTv2,是与美国QuantumDesign公司联合开发,成本较传统的荧光信号读取的仪器要高不少。在一定程度上限制了其POCT的应用场景。如何能够发挥磁纳米颗粒磁信号的最大优势,还用很长的一段路要走。


金磁纳米颗粒应用于梅毒抗体的检测示意图



根据我们之前对市场上部分产品的统计,目前国内已经实现商业化的LFIA产品中,金探针和传统的荧光探针仍然占据最主要的地位,虽然关于量子点和磁颗粒在LFIA中应用的研究已经有很多,但真正应用到市场中的并不多。


尽管如文中所述,不同的纳米颗粒有着各种各样的独特优点,为LFIA的发展也做出了很大贡献,但仍然有一些问题需要解决。例如,纳米颗粒如何在保证性能的前提下实现批量生产,颗粒结合抗体时如何更好地保护抗体的生物活性和抗原结合能力,颗粒暴露在不同pH和电解质浓度的样品中如何保证稳定性和单分散性,等等。无论如何,纳米颗粒标签的进步有望推动LFIA的发展,并在临床诊断、食物安全检测、环境监测等领域得到更好的应用。

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